Regulation of Inflammatory Response and Osteogenesis to Citrate-Based Biomaterials through Incorporation of Alkaline Fragments

通過(guò)摻入堿性片段調(diào)節(jié)檸檬酸鹽生物材料的炎癥反應(yīng)和成骨作用

來(lái)源：Adv. Healthcare Mater. 2022, 11, 2101590

 

一、摘要概述

 

本文針對(duì)檸檬酸鹽基生物材料（如POC）降解過(guò)程中釋放檸檬酸導(dǎo)致微環(huán)境酸化的問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一種新型堿性片段BHEp改性的聚檸檬酸酯（POPC）。通過(guò)將BHEp引入聚(檸檬酸-1,8-辛二醇)（POC）主鏈，合成POPC聚合物，并與β-磷酸三鈣（β-TCP）復(fù)合制備3D打印多孔支架（PTCP）。研究證實(shí)：

 

堿性中和作用：BHEp有效中和降解產(chǎn)生的酸性環(huán)境（圖3f），將pH穩(wěn)定在7.0-7.2（生理范圍）。

 

 

細(xì)胞行為改善：POPC15（15% BHEp）顯著促進(jìn)rBMSCs黏附、增殖及成骨基因表達(dá)（圖6b-c），并降低巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)（圖7e）。

 

 

 

骨再生增強(qiáng)：大鼠股骨缺損模型中，PTCP15支架顯著提升新骨形成（圖8）與骨整合（圖9）。

 

 

 

研究為調(diào)控生物材料降解微環(huán)境提供了新策略。

 

二、研究目的

 

解決降解酸化問(wèn)題：傳統(tǒng)檸檬酸鹽材料（如POC）降解釋放檸檬酸，導(dǎo)致pH下降（<6.5），抑制細(xì)胞活性與骨再生。

 

優(yōu)化材料性能：通過(guò)引入堿性片段BHEp，中和酸性微環(huán)境，改善生物相容性。

 

驗(yàn)證骨修復(fù)效果：評(píng)估POPC/β-TCP支架在體外（細(xì)胞響應(yīng)）和體內(nèi)（骨缺損修復(fù)）的作用機(jī)制。

 

三、研究思路

 

采用 “材料設(shè)計(jì)→性能表征→生物學(xué)評(píng)價(jià)→動(dòng)物驗(yàn)證” 四步策略：

 

材料合成：

 

以檸檬酸、1,8-辛二醇和BHEp為單體，通過(guò)縮聚反應(yīng)合成POPC預(yù)聚物（圖1a）。

 

 

經(jīng)后聚合得到POPC彈性體，并與β-TCP復(fù)合，3D打印多孔支架（圖5a）。

 

 

性能表征：

 

化學(xué)結(jié)構(gòu)（FTIR/NMR，圖2a,d）、熱力學(xué)性質(zhì)（DSC/TGA，圖3a）、機(jī)械性能（圖3b）、溶脹與降解行為（圖3c,e）。

 

體外生物學(xué)評(píng)價(jià)：

 

細(xì)胞相容性（CCK-8，圖4a）、rBMSCs成骨分化（RT-qPCR/Western blot，圖6）、巨噬細(xì)胞炎癥響應(yīng)（流式細(xì)胞術(shù)/RT-qPCR，圖7）。

 

 

體內(nèi)骨再生驗(yàn)證：

 

大鼠股骨缺損模型，通過(guò)Micro-CT（圖8）和組織學(xué)（圖9）評(píng)估新骨形成。

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及其研究意義

1. 材料性能數(shù)據(jù)（圖3）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：圖3a-f（熱力學(xué)、機(jī)械、溶脹、降解、pH）。

 

關(guān)鍵結(jié)果：

 

POPC15的pH穩(wěn)定性最佳（Tris緩沖液中穩(wěn)定于7.2，圖3f）。

 

降解9周后POPC15失重僅40%，低于POC的80%（圖3e）。

 

研究意義：

 

BHEp通過(guò)質(zhì)子化中和檸檬酸（圖1b），避免pH驟降，為細(xì)胞提供適宜微環(huán)境。

 

適度的BHEp含量（15%）平衡了機(jī)械強(qiáng)度與降解速率（彈性模量10.46 MPa，圖3b）。

 

2. 細(xì)胞響應(yīng)數(shù)據(jù)（圖4, 6, 7）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：

 

圖4a（細(xì)胞增殖）、圖6b-c（成骨基因/蛋白表達(dá)）、圖7e（炎癥基因表達(dá)）。

 

關(guān)鍵結(jié)果：

 

rBMSCs在POPC15提取物中增殖率最高（CCK-8，圖4a）。

 

成骨基因（Runx2, OPN, Col I）表達(dá)上調(diào)2-3倍（圖6b）。

 

巨噬細(xì)胞促炎基因（IL-1β, TNF-α）下調(diào)，抗炎基因（IL-10）上調(diào)（圖7e）。

 

研究意義：

 

中性pH微環(huán)境促進(jìn)rBMSCs成骨分化，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促愈合表型（M2型）極化。

 

證實(shí)材料表面電荷（BHEp質(zhì)子化后帶正電）增強(qiáng)細(xì)胞黏附（接觸角49.5°，圖3d）。

 

3. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖8, 9）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：圖8（Micro-CT）、圖9（組織學(xué)）。

 

關(guān)鍵結(jié)果：

 

PTCP15組骨礦物密度（BMD）和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）顯著高于對(duì)照組（*p<0.05，圖8b）。

 

8周時(shí)缺損區(qū)形成成熟骨板（哈弗斯系統(tǒng)，圖9）。

 

研究意義：

 

堿性微環(huán)境協(xié)同多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)血管化骨再生，為臨床骨缺損修復(fù)提供新材料。

 

五、結(jié)論

 

材料創(chuàng)新性：BHEp的引入解決了檸檬酸鹽材料降解酸化的核心問(wèn)題，POPC15的綜合性能最優(yōu)。

 

機(jī)制明確：

 

pH緩沖：BHEp通過(guò)質(zhì)子化中和H?，維持微環(huán)境pH>7.0（圖3f）。

 

免疫調(diào)節(jié)：降低促炎因子表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化（圖7c-e）。

 

應(yīng)用價(jià)值：PTCP15支架顯著增強(qiáng)骨再生（圖8-9），為骨組織工程提供新策略。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

1. 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

 

高精度動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：

 

電極尖端直徑10 μm（響應(yīng)時(shí)間1-3秒），實(shí)現(xiàn) 微區(qū)pH實(shí)時(shí)追蹤（圖3f, 5c）。

 

直接輸出絕對(duì)pH值（非間接熒光法），避免自發(fā)熒光成像的定量偏差。

 

2. 關(guān)鍵數(shù)據(jù)意義（圖3f, 5c）

 

降解初期pH調(diào)控：

 

在Tris緩沖液中，POPC15的pH在12小時(shí)內(nèi)從7.0升至7.2，而POC驟降至7.2以下（圖3f）。

 

證明BHEp的即時(shí)中和能力：質(zhì)子化叔胺基團(tuán)（R?N + H? → R?NH?）消耗H?。

 

生理環(huán)境驗(yàn)證：

 

在無(wú)血清培養(yǎng)基中，PTCP15支架維持pH>7.0長(zhǎng)達(dá)7天（圖5c），克服傳統(tǒng)材料在復(fù)雜體液環(huán)境的不穩(wěn)定性。

 

3. 研究突破

 

定量關(guān)聯(lián)材料化學(xué)與生物學(xué)響應(yīng)：

 

Unisense數(shù)據(jù)直接關(guān)聯(lián)BHEp含量（15%）與pH穩(wěn)定性（圖3f），解釋細(xì)胞增殖差異（圖4a）。

 

揭示 “堿性片段→pH緩沖→細(xì)胞行為改善” 的因果鏈條（圖1b, 3f, 4a）。

 

技術(shù)不可替代性：

 

傳統(tǒng)pH試紙或熒光法無(wú)法實(shí)現(xiàn)秒級(jí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，Unisense電極為降解動(dòng)力學(xué)研究提供關(guān)鍵工具。

 

總結(jié)：本研究通過(guò)Unisense電極精準(zhǔn)量化POPC的pH緩沖能力，證實(shí)堿性片段BHEp是調(diào)控骨修復(fù)微環(huán)境的核心要素。其數(shù)據(jù)不僅解釋了材料降解的化學(xué)機(jī)制（H?中和），更將材料性能與生物學(xué)效應(yīng)（細(xì)胞增殖、成骨分化、炎癥調(diào)控）直接關(guān)聯(lián)，為設(shè)計(jì)下一代智能骨修復(fù)材料奠定基礎(chǔ)。