標(biāo)題：The transcriptional regulator RbcR controls ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 RbcR 控制藍(lán)藻集胞藻屬 (Synechocystis sp) 中的核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶加氧酶 (RuBisCO) 基因

來源：New Phytologist (2022) 235: 432–445, doi:10.1111/nph.18139

 

摘要核心內(nèi)容

本研究首次證實(shí)藍(lán)藻（Synechocystis sp. PCC 6803）中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 RbcR（由基因 sll0998 編碼）通過結(jié)合 rbcLXS 啟動(dòng)子調(diào)控 RuBisCO 基因表達(dá)，并定義其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：

1.RbcR 的必需性：敲除 rbcR 導(dǎo)致藍(lán)藻無法存活，表明其對細(xì)胞生存至關(guān)重要。

2.調(diào)控機(jī)制：RbcR 作為 LysR 型轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合靶基因啟動(dòng)子中的保守基序 ATTA(G/A)-N5-(C/T)TAAT，激活 rbcLXS（RuBisCO 編碼基因）、sbtA（碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和 ccmKL（羧酶體組分）等碳同化相關(guān)基因（表1）。

3.協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：RbcR 與已知碳調(diào)控因子 NdhR 和 CmpR 共同構(gòu)成藍(lán)藻碳同化三級調(diào)控系統(tǒng)，其中 RbcR 直接響應(yīng)碳限制條件，增強(qiáng)碳濃縮機(jī)制（CCM）。

4.應(yīng)用潛力：闡明 RbcR 調(diào)控機(jī)制為工程化藍(lán)藻細(xì)胞工廠（如 CO? 固定和化學(xué)品生產(chǎn)）提供新靶點(diǎn)。

 

研究目的

1.驗(yàn)證 RbcR 功能：明確 sll0998 基因產(chǎn)物是否調(diào)控 RuBisCO 及碳同化相關(guān)基因。

2.解析 DNA 結(jié)合特性：鑒定 RbcR 的 DNA 結(jié)合基序及其靶基因。

3.闡明調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：揭示 RbcR 在藍(lán)藻碳同化中的協(xié)同調(diào)控作用。

4.探索工程應(yīng)用：為藍(lán)藻碳固定效率優(yōu)化提供理論依據(jù)。

 

研究思路

采用 遺傳學(xué)-分子生物學(xué)-生理學(xué) 多維度策略：

1.遺傳操作：

1.構(gòu)建條件性 rbcR 敲低株（P0998）和過表達(dá)株（0998+），以野生型（WT）和啟動(dòng)子插入對照株（C0998）為基準(zhǔn)。

2.通過不完全分離突變體（P0998 保留 WT 等位基因）規(guī)避致死表型。

2.表達(dá)分析：

1.微陣列芯片篩選差異表達(dá)基因，Northern/Western blot 驗(yàn)證 rbcL 轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化。

3.DNA 互作驗(yàn)證：

1.EMSA 實(shí)驗(yàn)證實(shí) RbcR 蛋白特異性結(jié)合 rbcL、sbtA、ccmK 啟動(dòng)子。

2.基序突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證保守序列 ATTA(G/A)-N5-(C/T)TAAT 對結(jié)合的關(guān)鍵作用。

4.生理表型檢測：

1.測量光合放氧速率（丹麥 Unisense 微電極系統(tǒng)）、生長曲線及色素含量。

5.調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整合：

1.結(jié)合已有 NdhR/CmpR 調(diào)控?cái)?shù)據(jù)，構(gòu)建碳同化三級調(diào)控模型。

 

測量數(shù)據(jù)及其研究意義

研究通過多組學(xué)數(shù)據(jù)揭示 RbcR 功能，關(guān)鍵數(shù)據(jù)來源及意義如下：

 

1. 基因表達(dá)譜（表1，圖2）

數(shù)據(jù)來源：微陣列芯片分析 P0998 vs C0998。

核心發(fā)現(xiàn)：

orbcLXS（RuBisCO 基因）下調(diào) 4.6 倍（log? FC = -0.93）。

osbtA（HCO?? 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）下調(diào) 8 倍（log? FC = -2.99）。

occmK（羧酶體蛋白）下調(diào) 1.7 倍（log? FC = -0.75）。

意義：首次證實(shí) RbcR 正調(diào)控 RuBisCO 及 CCM 關(guān)鍵基因，填補(bǔ)藍(lán)藻碳同化轉(zhuǎn)錄調(diào)控空白。

 

2. 蛋白-DNA 互作（圖3）

數(shù)據(jù)來源：EMSA 實(shí)驗(yàn)（凝膠遷移阻滯分析）。

核心發(fā)現(xiàn)：

oRbcR-His 蛋白結(jié)合 rbcL 啟動(dòng)子（PrbcL），形成特異性復(fù)合物（圖3a）。

o突變保守基序（ATTA→GGGG）顯著降低結(jié)合親和力（圖4c）。

意義：揭示 RbcR 通過直接結(jié)合 DNA 基序調(diào)控靶基因，確立其轉(zhuǎn)錄激活因子身份。

 

3. 生理表型（圖1c-e）

數(shù)據(jù)來源：生長曲線、全細(xì)胞吸收光譜、光合放氧速率。

核心發(fā)現(xiàn)：

oP0998 生長減緩（圖1c）、葉綠素 a 含量降低（A680 nm↓，圖1d）。

o光合放氧速率下降（圖1e）。

意義：RbcR 缺失導(dǎo)致碳同化能力受損，印證其核心生理功能。

 

4. 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整合（圖5）

數(shù)據(jù)來源：啟動(dòng)子基序掃描與已知調(diào)控因子互作分析。

核心發(fā)現(xiàn)：

 

oRbcR 靶基因啟動(dòng)子含保守基序（圖4a），位置決定激活/抑制功能（-90 bp 激活，-10 bp 抑制）。

oRbcR 與 NdhR、CmpR 協(xié)同調(diào)控碳同化基因（如 sbtA 受三者共同調(diào)控）。

意義：構(gòu)建藍(lán)藻碳調(diào)控三級模型，為理性設(shè)計(jì)高固碳菌株提供靶點(diǎn)。

 

丹麥 Unisense 微電極測量數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

研究使用 Unisense O?-MR 微呼吸系統(tǒng)（型號：O?微傳感器）測量藍(lán)藻光合放氧速率，核心研究意義如下：

1. 技術(shù)原理

基于 Clark 型微電極，通過電化學(xué)檢測溶解氧濃度變化，空間分辨率達(dá)微米級。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

o藍(lán)藻細(xì)胞（OD??? = 0.5）經(jīng) N? 沖洗后，添加 5 mM NaHCO?。

o在 50 μmol photons·m?2·s?1 光強(qiáng)下監(jiān)測 5 分鐘放氧，隨后關(guān)燈監(jiān)測 2 分鐘耗氧（計(jì)算凈放氧速率）。

2. 關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)（圖1e）

RbcR 缺失株（P0998）光合受損：

o凈放氧速率顯著低于對照株（C0998）。

o意義：直接證明 RbcR 通過調(diào)控 RuBisCO 和 CCM 基因，影響藍(lán)藻光合碳同化效率。

關(guān)聯(lián)碳同化機(jī)制：

 

o放氧速率下降與 rbcL 表達(dá)降低（圖2）、RuBisCO 蛋白減少（圖2c）一致，證實(shí) RbcR 是碳同化限速步驟的轉(zhuǎn)錄調(diào)控樞紐。

3. 技術(shù)優(yōu)勢

原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測：克服傳統(tǒng)端點(diǎn)法局限，實(shí)時(shí)捕捉光合響應(yīng)。

高靈敏度：精準(zhǔn)量化低生物量樣本的代謝活性，適用于突變體表型分析。

 

結(jié)論

1.RbcR 是藍(lán)藻碳同化的核心轉(zhuǎn)錄激活因子：

o通過結(jié)合保守基序 ATTA(G/A)-N5-(C/T)TAAT，直接激活 rbcLXS、sbtA、ccmK 等基因表達(dá)。

2.三級調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：

oRbcR 與 NdhR（抑制 CCM 基因）、CmpR（激活 cmp 操縱子）協(xié)同響應(yīng)碳限制，優(yōu)化碳同化效率（圖5）。

3.工程應(yīng)用價(jià)值：

o靶向 RbcR 或其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可增強(qiáng)藍(lán)藻固碳能力，支持碳中和及光驅(qū)生物制造。

 

關(guān)鍵圖表索引：

圖1：rbcR 突變株構(gòu)建與表型（生長、色素、放氧速率）

圖2：rbcL 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)驗(yàn)證（Northern/Western blot）

圖3：RbcR 蛋白與靶啟動(dòng)子 DNA 結(jié)合（EMSA）

圖4：RbcR 結(jié)合基序鑒定與功能驗(yàn)證

圖5：藍(lán)藻碳同化三級調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型