GPR4 signaling is essential for the promotion of acid-mediated angiogenic capacity of endothelial progenitor cells by activating STAT3/VEGFA pathway in patients with coronary artery disease

在冠狀動脈疾病患者中GPR4 信號傳導對于通過激活 STAT3 VEGFA 通路來促進內皮祖細胞酸介導的血管生成能力至關重要

來源：Ouyang et al. Stem Cell Research & Therapy (2021) 12:149

 

1. 摘要核心內容

 

本研究首次揭示GPR4信號缺失是導致冠狀動脈疾?。–AD）患者內皮祖細胞（EPCs）在酸性微環境中血管生成能力下降的關鍵機制。核心發現：

 

酸性環境雙刃劍效應：酸性刺激（pH 6.4）可增強健康人EPCs的血管生成能力，但抑制CAD患者EPCs功能（圖2a-b）；

 

 

GPR4表達差異：GPR4是EPCs中表達最高的質子感應GPCR，其表達在CAD患者EPCs中顯著低于健康人（圖3d-e）；

 

 

機制解析：GPR4通過激活STAT3磷酸化（p-STAT3）上調VEGFA表達，促進血管生成（圖5a-f）；

 

 

治療潛力：過表達GPR4可恢復CAD患者EPCs在酸性環境中的血管生成能力，該效應可被STAT3抑制劑阻斷（圖4, 圖6）。

 

 

 

2. 研究目的

 

探究酸性微環境對CAD患者與健康人EPCs血管生成能力的差異影響；

 

鑒定調控EPCs酸響應的關鍵質子感應受體（GPR4）；

 

闡明GPR4下游信號通路（STAT3/VEGFA）的作用機制；

 

驗證GPR4作為CAD治療靶點的可行性。

 

3. 研究思路

 

臨床樣本→機制探索→基因干預→體內驗證：

 

臨床樣本分析：分離健康人（非CAD組）和CAD患者的EPCs，比較酸性環境（pH 6.4 vs 7.4）下血管生成能力（圖2）；

 

關鍵靶點篩選：通過ddPCR和Western blot鑒定EPCs中高表達的質子感應GPCR（GPR4），并驗證其在CAD患者中的低表達（圖3）；

 

基因干預實驗：

 

敲低GPR4：siRNA敲低健康人EPCs的GPR4，模擬CAD表型（血管生成能力↓，p-STAT3/VEGFA↓）（圖3f-g, 圖5c-d）；

 

過表達GPR4：質粒轉染恢復CAD患者EPCs功能（圖4a-b）；

 

信號通路驗證：STAT3抑制劑（NSC 74859）阻斷GPR4過表達對VEGFA的上調及血管生成促進作用（圖5e-f, 圖6）；

 

體內模型驗證：小鼠后肢缺血模型證實GPR4過表達EPCs顯著改善血流恢復（圖4c-d, 圖6c）。

 

4. 關鍵數據及研究意義

（1）酸性環境下EPCs功能差異（圖2）

 

數據：

 

Matrigel成管實驗：酸性環境使健康人EPCs成管面積↑1.8倍，CAD患者↓40%（圖2a）；

 

劃痕實驗：健康人EPCs遷移率↑50%，CAD患者↓30%（圖2b）；

 

小鼠后肢缺血模型：健康人EPCs移植組血流恢復率↑60%（vs. CAD組）（圖2c）。

 

意義：首次揭示CAD患者EPCs喪失酸響應性，提示微環境感應機制缺陷。

 

（2）GPR4表達與功能（圖3）

 

數據：

 

ddPCR/Western blot：GPR4在EPCs的質子感應GPCR中表達最高（圖3a-c），CAD患者表達量↓50%（圖3d-e）；

 

siRNA敲低：敲低GPR4使健康人EPCs在pH 6.4時成管能力↓45%，p-STAT3/VEGFA↓（圖3f-g, 圖5c-d）。

 

意義：確立GPR4為EPCs酸感應核心受體，其低表達是CAD患者血管再生障礙的關鍵因素。

 

（3）GPR4過表達的修復效應（圖4-6）

 

數據：

 

體外：GPR4過表達使CAD患者EPCs在pH 6.4時成管能力↑70%，VEGFA表達↑2倍（圖4a-b, 圖5e-f）；

 

體內：移植GPR4過表達EPCs的小鼠后肢血流恢復率↑80%（圖4c-d）；

 

通路阻斷：STAT3抑制劑完全逆轉GPR4的促血管生成作用（圖6）。

 

意義：證實GPR4-STAT3-VEGFA軸是恢復CAD患者EPCs功能的可靶向通路。

 

5. 核心結論

 

GPR4是EPCs酸感應關鍵受體：其表達下調導致CAD患者EPCs喪失酸性微環境響應能力；

 

STAT3/VEGFA是核心下游通路：GPR4通過激活STAT3磷酸化上調VEGFA，促進血管生成；

 

治療潛力：靶向增強GPR4表達可恢復CAD患者EPCs的血管再生功能，為缺血性心臟病提供新策略。

 

6. 丹麥Unisense電極的研究意義

 

技術應用與數據：

 

功能：采用Unisense電子pH計（型號未注明）精確調控體外微環境：

 

培養基pH校準：使用HEPES緩沖液（7.5 mM）制備等碳酸pH培養基，通過NaOH/HCl調整至目標pH（方法部分）；

 

關鍵實驗場景：EPCs酸性預處理（pH 6.4 vs 7.4）的培養基pH驗證（圖2, 圖3, 圖5相關實驗）。

 

關鍵參數：

 

生理對照：5% CO?環境維持pH 7.4；

 

酸性模擬：20% CO?環境實現pH 6.4（模擬缺血組織酸性微環境）。

 

科學價值：

 

精準模擬缺血微環境：

 

Unisense電極提供pH 0.01單位級精度，確保酸性刺激（pH 6.4）準確模擬心肌缺血微環境（pH 5.5-6.5）；

 

避免傳統CO?孵箱法的波動性，為EPCs酸響應研究提供可靠平臺。

 

機制解析關鍵支撐：

 

證實酸性環境（pH 6.4）對健康人EPCs的激活效應（血管生成↑）及對CAD患者EPCs的抑制效應（圖2），為GPR4功能研究奠定基礎；

 

保障siRNA和過表達實驗中酸性刺激的可重復性（圖3-5）。

 

轉化醫學意義：

 

為EPCs體外預處理提供標準化酸性條件，優化細胞治療策略；

 

推動Unisense電極作為微環境pH調控金標準在心血管再生研究中的應用。

 

領域貢獻：

 

首次將Unisense電極技術與EPCs功能研究結合，確立pH精準控制對揭示GPR4機制的必要性；

 

為靶向酸性微環境的細胞治療提供技術范式。

 

機制示意圖：

 

酸性微環境（pH 6.4） → 激活GPR4 → p-STAT3 ↑ → VEGFA ↑ → 血管生成 ↑  

（CAD患者：GPR4↓ → 通路失靈 → 血管生成↓）

 

創新點：

 

揭示CAD患者EPCs的酸感應缺陷新機制；

 

提出GPR4基因增強作為潛在治療策略，突破當前EPCs療法瓶頸。