Two uptake hydrogenases differentially interact with the aerobic respiratory chain during mycobacterial growth and persistence

兩種攝取氫化酶在分枝桿菌生長和持久期間與需氧呼吸鏈差異互動

來源：Journal of Biological Chemistry, Volume 294, Issue 50, 2019, Pages 18980-18991

《生物化學(xué)雜志》第294卷第50期，2019年，第18980-18991頁

 

摘要

論文摘要闡述了分枝桿菌Mycobacterium smegmatis擁有兩種氧耐受的[NiFe]氫化酶Huc和Hhy，它們能夠氧化氫氣到亞大氣濃度，增強(qiáng)細(xì)菌在缺氧和碳限制下的生存。研究發(fā)現(xiàn)Huc和Hhy在表達(dá)、定位和與呼吸鏈整合方面存在差異：Huc在指數(shù)生長后期和靜止期早期活躍，支持混合營養(yǎng)生長和進(jìn)入休眠；Hhy在長期持久期活躍，為維持過程提供能量。兩者都通過menaquinone池與需氧呼吸鏈 obligately 連接，但差異地影響終端氧化酶。Huc專門捐贈電子給細(xì)胞色素bcc-aa3超復(fù)合物，而Hhy也提供給細(xì)胞色素bd氧化酶復(fù)合物。這些發(fā)現(xiàn)表明Huc和Hhy在分枝桿菌生長和生存中扮演 distinct 角色。

 

研究目的

研究目的是探究為什么M. smegmatis需要兩種功能相似的氫化酶，并確定它們在生長和持久期的不同作用，包括它們?nèi)绾闻c呼吸鏈互動，以理解氫化酶在能量代謝中的分工和適應(yīng)策略。

 

研究思路

研究思路采用多方法結(jié)合：使用分子生物學(xué)技術(shù)（如qRT-PCR）測量氫化酶基因表達(dá)；通過電生理學(xué)方法（如微電極）實(shí)時監(jiān)測氫氣和氧氣消耗；利用生物化學(xué)方法（如 native PAGE、zymographic staining、質(zhì)譜分析）研究氫化酶活性和與呼吸鏈的相互作用；通過抑制劑和解偶聯(lián)劑實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證電子傳遞路徑；使用突變體菌株（只表達(dá)Huc或Hhy）進(jìn)行功能比較。所有實(shí)驗(yàn)在碳限制和不同生長階段進(jìn)行，以模擬自然條件。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)：通過qRT-PCR測量hucL和hhyL轉(zhuǎn)錄水平，顯示Huc在碳限制早期（1天后Amax）高表達(dá)，Hhy在持久期（3周后Amax）高表達(dá)（圖1a,b）。研究意義：揭示氫化酶的差異時序調(diào)節(jié)，適應(yīng)生長過渡和持久維持的能量需求。

 

2 氫氣氧化速率：使用氫氣微電極測量WT和突變體菌株的H2氧化速率，顯示Huc在過渡期（1天后Amax）活性高，Hhy在持久期（3周后Amax）活性高（圖1c-f）。研究意義：證實(shí)氫化酶活性與表達(dá)一致，支持Huc用于混合營養(yǎng)生長，Hhy用于長期能量供應(yīng)。

3 氫化酶活性染色：通過 native PAGE 和 zymographic staining 顯示Huc和Hhy的分子量不同，Huc形成高分子量物種（>700 kDa），可能與其他蛋白復(fù)合，Hhy形成中分子量物種（圖2a）。研究意義：表明氫化酶可能與呼吸鏈組件形成物理關(guān)聯(lián)，影響電子傳遞效率。

 

 

4 細(xì)胞分餾和Western blot：顯示Huc和Hhy的膜關(guān)聯(lián)性，Huc可被膽酸鹽溶解，Hhy更緊密膜結(jié)合（圖2b）。研究意義：揭示氫化酶與膜的不同相互作用方式，Huc可能通過蛋白互作關(guān)聯(lián)，Hhy可能更直接嵌入。

5 氧氣消耗測量：使用氧氣微電極顯示H2氧化與O2消耗耦合，化學(xué)計量比約2:1（H2:O2），證實(shí)呼吸鏈電子傳遞（圖3a）。研究意義：證明H2作為呼吸電子供體，支持氧化磷酸化。

 

6 抑制劑實(shí)驗(yàn)：使用HQNO（menaquinone抑制劑）和鋅疊氮（細(xì)胞色素bcc-aa3抑制劑）顯示氫化酶活性依賴menaquinone和終端氧化酶（圖3b,c，圖4）。研究意義：確認(rèn)電子通過menaquinone池傳遞，且Huc主要耦合細(xì)胞色素bcc-aa3，Hhy更靈活也耦合細(xì)胞色素bd。

 

7 解偶聯(lián)劑實(shí)驗(yàn)：使用valinomycin和nigericin顯示Huc活性依賴完整質(zhì)子動力，Hhy活性更耐受變化（圖4）。研究意義：表明Huc需要高質(zhì)子動力可能因其與質(zhì)子泵復(fù)合物關(guān)聯(lián)，Hhy更適應(yīng)低能量狀態(tài)。

 

結(jié)論

1 Huc和Hhy在分枝桿菌生長和持久期扮演 distinct 角色：Huc支持從生長到休眠的過渡，通過混合營養(yǎng)提供能量；Hhy支持長期持久，維持基本代謝。

2 兩者都通過menaquinone池與呼吸鏈耦合，但互動方式不同：Huc專門與細(xì)胞色素bcc-aa3超復(fù)合物互動，可能形成物理關(guān)聯(lián)；Hhy與細(xì)胞色素bcc-aa3和bd都互動，提供電子傳遞靈活性。

3 氫化酶氧化大氣H2為分枝桿菌提供關(guān)鍵能量源，適應(yīng)碳限制環(huán)境，增強(qiáng)生存能力。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense氫氣和氧氣微電極測量的數(shù)據(jù)在研究中具有核心作用。這些電極高靈敏度、實(shí)時監(jiān)測氣體濃度變化，允許精確量化氫化酶活性和呼吸速率。例如，圖3a中電極數(shù)據(jù)直接顯示H2氧化和O2消耗的耦合，證實(shí)H2作為電子供體進(jìn)入呼吸鏈， stoichiometry 約2:1，支持氧化磷酸化。抑制劑實(shí)驗(yàn)中（圖3b,c），電極測量顯示HQNO和鋅疊氮對活性的抑制，驗(yàn)證了menaquinone和終端氧化酶的必需性。解偶聯(lián)劑實(shí)驗(yàn)（圖4）進(jìn)一步揭示Huc和Hhy對質(zhì)子動力的不同依賴性，Unisense電極提供了可靠動力學(xué)數(shù)據(jù)。總之，Unisense電極的應(yīng)用確保了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，為理解氫化酶在能量代謝中的機(jī)制提供了直接證據(jù)。