Measurement of the Extracellular pH of Adherently Growing Mammalian Cells with High Spatial Resolution Using a Voltammetric pH Microsensor

使用伏安法pH微傳感器高空間分辨率測量貼壁生長哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞外pH

來源: Analytical Chemistry, 2018, Volume 90, Pages 6899-6905

《分析化學(xué)》，2018年，第90卷，第6899-6905頁

 

摘要：

這篇論文的摘要指出，目前缺乏高空間分辨率測量貼壁生長哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞外pH（pHe）的工具，細(xì)胞生物學(xué)家通常局限于使用商業(yè)熒光探針測量細(xì)胞內(nèi)pH。因此，作者開發(fā)了一種伏安法pH微傳感器，由修飾了還原氧化石墨烯和syringaldazine的碳纖維微電極組成，用于監(jiān)測細(xì)胞外pH。該傳感器具有良好的靈敏度（60±2.5 mV/pH單位）、重現(xiàn)性（系數(shù)變異≤3%）和穩(wěn)定性（3小時(shí)內(nèi)pH漂移約0.05單位），并成功用于研究癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞細(xì)胞外空間的酸化，揭示了細(xì)胞pH調(diào)節(jié)的細(xì)節(jié)，這些細(xì)節(jié)無法用缺乏空間分辨率或無法精確定位的pH傳感器獲得。

 

研究目的：

研究目的是開發(fā)一種高空間分辨率的伏安法pH微傳感器，用于測量貼壁生長哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞外pH，以克服現(xiàn)有工具的局限性，如熒光方法的淬滅和光漂白問題，或電化學(xué)傳感器的易碎性和響應(yīng)時(shí)間長問題。最終目標(biāo)是能夠以高空間分辨率監(jiān)測細(xì)胞外pH，從而研究細(xì)胞異質(zhì)性，特別是在癌癥細(xì)胞中pH調(diào)節(jié)的差異。

 

研究思路：

研究思路首先聚焦于構(gòu)建和優(yōu)化pH微傳感器。具體步驟包括：制造碳纖維微電極（直徑37μm），通過吸附石墨烯氧化物和syringaldazine進(jìn)行修飾，然后電化學(xué)還原石墨烯氧化物以增加電化學(xué)活性表面積。傳感器校準(zhǔn)使用已知pH值的溶液，通過循環(huán)伏安法記錄syringaldazine的氧化還原峰電位與pH的關(guān)系。隨后，使用掃描電化學(xué)顯微鏡（SECM）將傳感器精確定位在細(xì)胞外空間（距離細(xì)胞約24-29μm），測量近細(xì)胞處pH（pHclose）和遠(yuǎn)離細(xì)胞處pH（pHfar），計(jì)算pH梯度。實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（HT-29，在常氧和缺氧條件下）和正常人類胚胎腎細(xì)胞（HEK-293，轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染），以比較不同細(xì)胞類型的pHe差異。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義：

1. pH微傳感器的靈敏度數(shù)據(jù)：通過校準(zhǔn)曲線得到靈敏度為60±2.5 mV/pH單位，接近理論值（59 mV/pH單位）。這些數(shù)據(jù)來自圖2，其中顯示了循環(huán)伏安圖和校準(zhǔn)曲線。研究意義：驗(yàn)證傳感器性能，確保其能準(zhǔn)確測量生物相關(guān)pH范圍，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供可靠工具。

 

2. pH微傳感器的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)：通過五組傳感器測試，顯示系數(shù)變異≤3%，表明傳感器構(gòu)建一致。這些數(shù)據(jù)來自圖3，顯示了平均校準(zhǔn)曲線。研究意義：確保傳感器可重復(fù)使用，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高數(shù)據(jù)可靠性。

 

3. pH微傳感器的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)：在3小時(shí)內(nèi)pH漂移約0.05單位，表明傳感器適合長時(shí)間實(shí)驗(yàn)。這些數(shù)據(jù)來自圖4，顯示了pH隨時(shí)間的變化。研究意義：證明傳感器在細(xì)胞測量中穩(wěn)定，能夠捕捉細(xì)微pH變化而不受漂移影響。

 

4. 細(xì)胞外pH測量數(shù)據(jù)：測量了不同細(xì)胞類型的pHclose和pHfar，計(jì)算pH梯度。例如，缺氧HT-29細(xì)胞平均pHe為7.03，常氧HT-29為7.13，正常細(xì)胞為7.18-7.21，并顯示pH梯度分布。這些數(shù)據(jù)來自圖5，顯示了pH梯度的百分比分布。研究意義：揭示細(xì)胞異質(zhì)性，癌癥細(xì)胞具有更酸性細(xì)胞外空間，且缺氧細(xì)胞pH梯度更大，有助于理解癌癥細(xì)胞pH調(diào)節(jié)機(jī)制和異質(zhì)性對(duì)治療的影響。

 

 

結(jié)論：

論文得出結(jié)論，開發(fā)的伏安法pH微傳感器通過還原氧化石墨烯增強(qiáng)，具有高靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，結(jié)合SECM精確定位，能夠高空間分辨率測量細(xì)胞外pH。研究發(fā)現(xiàn)，癌癥細(xì)胞（尤其是缺氧條件下）細(xì)胞外空間更酸性，且癌癥細(xì)胞表現(xiàn)出更高的pH梯度異質(zhì)性，而正常細(xì)胞pH梯度較均勻。這證明了傳感器能捕捉細(xì)胞pH調(diào)節(jié)的細(xì)節(jié)，為研究細(xì)胞異質(zhì)性和疾病機(jī)制提供了新工具。未來可通過減小傳感器尺寸和優(yōu)化SECM實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測量。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義：

論文中提及丹麥Unisense A/S的玻璃pH微傳感器作為現(xiàn)有高空間分辨率pH測量工具的例子，用于測量細(xì)菌生物膜等系統(tǒng)的pH。但論文指出，這類電位法傳感器易碎、響應(yīng)時(shí)間長、需要光學(xué)顯微鏡輔助定位，且壽命有限。因此，Unisense電極的數(shù)據(jù)研究意義在于它突出了現(xiàn)有工具的局限性，強(qiáng)調(diào)了開發(fā)更優(yōu)傳感器（如本論文的伏安法傳感器）的必要性。Unisense電極在其他研究中證明了高空間分辨率pH測量的可行性，但本論文的傳感器通過伏安法克服了缺點(diǎn)，如更易定位、更快響應(yīng)，從而更適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究，推動(dòng)細(xì)胞pH測量技術(shù)的發(fā)展。