A comprehensive study of the toxicity of natural multi-contaminated sediments: New insights brought by the use of a combined approach using the medaka embryo-larval assay and physico-chemical analyses

對(duì)天然多污染沉積物毒性的全面研究利用青鳉胚胎-幼蟲分析和理化分析相結(jié)合的方法帶來的新見解

來源：Ecotoxicology and Environmental Safety 142 (2017) 509–521

 

論文摘要

本研究旨在綜合評(píng)估自然多污染沉積物的毒性。研究團(tuán)隊(duì)在法國西南部的洛特-加龍河連續(xù)體（Lot-Garonne continuum）中選取了六個(gè)具有對(duì)比性的站點(diǎn)，采集了沉積物樣本。通過結(jié)合日本青鳉魚胚胎幼蟲沉積物接觸試驗(yàn)和詳盡的沉積物理化性質(zhì)與污染物分析，并運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)方法，本研究揭示了影響沉積物毒性的不同因素?；瘜W(xué)分析表明，沉積物的污染特征（主要受金屬痕量元素和，出乎意料地，多環(huán)芳烴影響）存在顯著差異。與參考點(diǎn)相比，暴露于這些沉積物對(duì)青鳉魚早期生命階段產(chǎn)生了不同的毒性影響。主成分分析表明，來自洛特河及其支流的沉積物所引發(fā)的毒性反應(yīng)與微污染物污染相關(guān)（如生物測(cè)量指標(biāo)、孵化成功率、遺傳毒性、顱面畸形和卵黃囊吸收不良與金屬和有機(jī)污染物特異性相關(guān)）。相反，暴露于加龍河沉積物產(chǎn)生的主要生物反應(yīng)更可能與其理化性質(zhì)（如有機(jī)質(zhì)含量、細(xì)顆粒物比例和溶解氧水平）相關(guān)，而非其污染程度。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了將沉積物理化分析與毒性評(píng)估相結(jié)合，以準(zhǔn)確評(píng)估沉積物污染相關(guān)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的必要性。

研究目的

本研究的主要目的是：

 

綜合評(píng)估沉積物毒性：在一個(gè)具有歷史性多金屬污染的河流系統(tǒng)（洛特-加龍河連續(xù)體）中，評(píng)估多種自然污染沉積物的毒性。

區(qū)分毒性驅(qū)動(dòng)因子：探究是污染物濃度還是沉積物的固有理化性質(zhì)（如顆粒大小、有機(jī)質(zhì)含量）是導(dǎo)致觀察到的毒性效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)因素。

驗(yàn)證生物檢測(cè)方法：應(yīng)用并驗(yàn)證一種名為MELAc的檢測(cè)方法，即讓青鳉魚胚胎直接接觸整體沉積物，以更真實(shí)地模擬自然環(huán)境中的暴露情況。

 

建立效應(yīng)-原因關(guān)系：通過多元統(tǒng)計(jì)分析（如主成分分析PCA和相關(guān)性分析），將特定的毒性終點(diǎn)（如畸形、生長抑制、DNA損傷）與具體的污染物類別或理化參數(shù)聯(lián)系起來，從而為毒性機(jī)制提供見解。

 

研究思路

研究遵循了一個(gè)系統(tǒng)性的“現(xiàn)場(chǎng)采樣-實(shí)驗(yàn)室分析-數(shù)據(jù)整合-機(jī)理闡釋”的思路：

 

站點(diǎn)選擇與采樣：在洛特-加龍河連續(xù)體上選擇了六個(gè)沉積物污染特征和理化性質(zhì)具有對(duì)比性的站點(diǎn)（圖1），包括一個(gè)參考點(diǎn)（Marcenac）和五個(gè)受不同歷史工業(yè)活動(dòng)影響程度不同的污染點(diǎn)。

 

 

沉積物全面表征：

 

理化性質(zhì)：分析了顆粒大小分布（特別是細(xì)顆粒物<63μm的比例）、顆粒有機(jī)碳含量、孔隙水中的銨離子濃度。

 

污染物分析：定量檢測(cè)了10種金屬痕量元素（如Cd, Pb, Zn, Cu等）和多種有機(jī)污染物（包括21種多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、多溴二苯醚等）的含量。所有數(shù)據(jù)匯總于表1。

 

生物毒性檢測(cè)（MELAc）：將青鳉魚胚胎直接置于沉積物表面進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)到孵化后一段時(shí)間。監(jiān)測(cè)了多種毒性終點(diǎn)：

 

急性毒性：胚胎和幼蟲存活率、孵化成功率。

發(fā)育毒性：孵化時(shí)間、幼蟲體長和頭部長度（圖2A, B）、各類畸形發(fā)生率（如脊柱、心血管、顱面畸形等，數(shù)據(jù)見表2）。

 

 

生理效應(yīng)：在不同發(fā)育階段（6 dpf和7 dpf）的心率（圖2C）。

 

遺傳毒性：使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)孵化后幼蟲的DNA損傷（圖2D）。

 

數(shù)據(jù)整合與統(tǒng)計(jì)分析：運(yùn)用主成分分析將所有的理化數(shù)據(jù)、污染物濃度數(shù)據(jù)和生物毒性數(shù)據(jù)整合在一起，以可視化不同站點(diǎn)間的差異，并識(shí)別哪些環(huán)境變量與特定的毒性效應(yīng)共同變化（圖3）。同時(shí)進(jìn)行了相關(guān)性分析以驗(yàn)證這些關(guān)系。

 

 

測(cè)量數(shù)據(jù)及其研究意義

研究測(cè)量了多個(gè)方面的數(shù)據(jù)，其意義和來源如下：

 

沉積物理化性質(zhì)（界定沉積物基本特征）

 

測(cè)量指標(biāo)：顆粒大小（特別是<63μm的細(xì)顆粒百分比）、顆粒有機(jī)碳含量、孔隙水銨離子濃度。

研究意義：這些數(shù)據(jù)（表1）是理解污染物行為和生物可利用度的基礎(chǔ)。例如，細(xì)顆粒和有機(jī)質(zhì)通常對(duì)污染物有較強(qiáng)的吸附能力。分析發(fā)現(xiàn)，加龍河站點(diǎn)的沉積物（如Bdx和LR）具有較高的細(xì)顆粒和有機(jī)碳含量，這為其毒性主要受理化性質(zhì)驅(qū)動(dòng)的結(jié)論提供了關(guān)鍵背景。

 

數(shù)據(jù)來源：表1。

 

沉積物污染物濃度（直接量化污染負(fù)荷）

 

測(cè)量指標(biāo)：多種金屬痕量元素和有機(jī)污染物（多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等）的濃度。

研究意義：表1顯示了各站點(diǎn)截然不同的污染特征。例如，Joanis和Bouillac站點(diǎn)金屬污染極為嚴(yán)重，而Le Temple站點(diǎn)則富含多環(huán)芳烴。這是進(jìn)行毒性歸因分析的根本依據(jù)。通過計(jì)算平均PEC商數(shù)，研究者對(duì)沉積物的潛在毒性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并與生物測(cè)試結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

 

數(shù)據(jù)來源：表1。

 

青鳉魚胚胎幼蟲毒性終點(diǎn)（綜合評(píng)估生物效應(yīng)）

 

測(cè)量指標(biāo)：存活率、孵化時(shí)間、生長指標(biāo)（體長、頭長）、畸形類型和發(fā)生率、心率、DNA損傷指標(biāo)（Tail DNA%和“hedgehog”細(xì)胞%）。

研究意義：圖2和 表2是核心發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)顯示，所有污染站點(diǎn)均對(duì)青鳉魚早期發(fā)育產(chǎn)生了顯著亞致死毒性效應(yīng)。圖2A, B顯示Joanis站點(diǎn)的沉積物導(dǎo)致孵化延遲和幼蟲生長顯著抑制。表2表明某些站點(diǎn)（如LR, Bo, Jo）的畸形率高達(dá)70%，遠(yuǎn)高于參考點(diǎn)。圖2C揭示了心率在發(fā)育過程中的復(fù)雜變化（6 dpf加速，7 dpf減速）。圖2D表明某些沉積物能引起顯著的DNA損傷。這些多維度的生物效應(yīng)數(shù)據(jù)為后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析提供了豐富素材。

 

數(shù)據(jù)來源：圖2A, B, C, D和 表2。

 

多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（揭示驅(qū)動(dòng)毒性的關(guān)鍵因素）

 

測(cè)量指標(biāo)：主成分分析產(chǎn)生的因子載荷圖和各站點(diǎn)在因子平面上的分布。

研究意義：圖3是本研究的精髓。PCA結(jié)果清晰地將毒性效應(yīng)分為兩大簇群：一簇（與PC1相關(guān)）與污染物濃度高度相關(guān)，包括生長抑制、孵化成功、遺傳毒性和顱面畸形等，這些效應(yīng)主要出現(xiàn)在洛特河流域的污染站點(diǎn)（如Joanis）。另一簇（與PC2相關(guān)）與沉積物的理化性質(zhì)（如高有機(jī)質(zhì)、細(xì)顆粒物含量）高度相關(guān)，包括孵化延遲、心血管和脊柱畸形等，這些效應(yīng)主要出現(xiàn)在加龍河站點(diǎn)（如Bordeaux, La Réole）。這張圖直觀地證明了毒性驅(qū)動(dòng)因素的二元性。

 

數(shù)據(jù)來源：圖3。

 

研究結(jié)論

 

毒性驅(qū)動(dòng)因素的二元性：本研究最核心的結(jié)論是，自然沉積物的毒性并非僅由污染物濃度決定。沉積物本身的理化性質(zhì)（如有機(jī)質(zhì)含量、顆粒組成）是獨(dú)立于污染物濃度的重要毒性驅(qū)動(dòng)因素，甚至在某些情況下是主導(dǎo)因素。

特異性生物標(biāo)志物：研究識(shí)別出了對(duì)污染物暴露敏感且相對(duì)不受沉積物理化性質(zhì)干擾的特異性生物標(biāo)志物，如幼蟲體長、遺傳毒性（Tail DNA）、孵化成功率等。這些標(biāo)志物更適合用于評(píng)估污染物本身的毒性。

需謹(jǐn)慎解讀的生物標(biāo)志物：同時(shí)，也識(shí)別出一些易受沉積物固有性質(zhì)（如缺氧）影響的非特異性生物標(biāo)志物，如孵化時(shí)間、脊柱和心血管畸形、早期心率等。在解釋這些標(biāo)志物的變化時(shí)，需要格外謹(jǐn)慎，必須結(jié)合沉積物的理化參數(shù)（尤其是溶解氧）進(jìn)行分析，以避免“假陽性”判斷。

綜合評(píng)估的必要性：?jiǎn)为?dú)依靠化學(xué)分析（如PEC商數(shù)）來預(yù)測(cè)毒性可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)。例如，一些化學(xué)污染不高的沉積物因其“不良”的理化性質(zhì)（導(dǎo)致缺氧）而表現(xiàn)出高毒性；反之，一些高污染的沉積物因污染物生物可利用度低而毒性相對(duì)較低。因此，必須將化學(xué)分析與生物檢測(cè)相結(jié)合，才能對(duì)沉積物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)做出準(zhǔn)確評(píng)估。

 

MELAc方法的有效性：研究證實(shí)了青鳉魚胚胎沉積物接觸試驗(yàn)是一種能夠有效整合污染物生物可利用度和沉積物基質(zhì)效應(yīng)的、可靠的體內(nèi)毒性測(cè)試工具。

 

丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

在本研究中，丹麥Unisense電極（特指溶解氧微電極）的測(cè)量數(shù)據(jù)雖然未在結(jié)果部分以獨(dú)立圖表展示，但其在實(shí)驗(yàn)過程中扮演了至關(guān)重要的質(zhì)量控制和支持性角色，其研究意義深刻且不可或缺：

 

確保實(shí)驗(yàn)條件的可靠性與可比性：在整個(gè)為期10天的青鳉魚胚胎沉積物接觸暴露實(shí)驗(yàn)中，研究人員每日使用Unisense氧微電極監(jiān)測(cè)沉積物-水界面的溶解氧濃度。文獻(xiàn)中提到：“Dissolved oxygen was also measured daily throughout the 10-day exposure period at the water-sediment interface using a Clark-type sensor equipped with a guard cathode(Unisense, Aarhus, DK)”。這一做法的首要意義在于確保所有實(shí)驗(yàn)組（包括參考組和不同污染沉積物組）的暴露條件，特別是氧含量，處于可控和可比的狀態(tài)。溶解氧是影響胚胎發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因子，其波動(dòng)會(huì)直接引起應(yīng)激反應(yīng)，干擾對(duì)污染物特異性毒性的判斷。通過每日監(jiān)測(cè)，研究者確保了實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性。

為“理化性質(zhì)驅(qū)動(dòng)毒性”的關(guān)鍵結(jié)論提供直接證據(jù)：本研究的核心發(fā)現(xiàn)之一是加龍河沉積物的毒性與其理化性質(zhì)（如高有機(jī)質(zhì)、細(xì)顆粒物含量）密切相關(guān)。這些性質(zhì)極易導(dǎo)致沉積物-水界面微環(huán)境的缺氧。Unisense電極的測(cè)量數(shù)據(jù)證實(shí)了這一點(diǎn)：加龍河站點(diǎn)的沉積物（Bdx和LR）培養(yǎng)體系中的平均溶解氧水平（約88%飽和度）顯著低于參考點(diǎn)。盡管這個(gè)值仍在OECD指南可接受范圍內(nèi)（>80%），但這種程度的降低足以對(duì)發(fā)育中的胚胎構(gòu)成脅迫。這為解釋為何這些化學(xué)污染水平不高的沉積物卻能引起顯著毒性（如孵化延遲、心血管畸形）提供了直接的機(jī)理性證據(jù)。缺氧本身就是一種致畸因子，可以解釋觀察到的特定畸形類型。

支持統(tǒng)計(jì)分析中的關(guān)鍵相關(guān)性：在后續(xù)的相關(guān)性分析和主成分分析中，溶解氧水平被證明與多個(gè)毒性終點(diǎn)顯著相關(guān)。例如，孵化時(shí)間、6 dpf的心率以及畸形幼蟲的百分比均與溶解氧濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（圖3和文中相關(guān)性表格）。這意味著，溶解氧越低，這些毒性效應(yīng)越嚴(yán)重。Unisense電極提供的精確、高分辨率的溶解氧數(shù)據(jù)是進(jìn)行這些統(tǒng)計(jì)分析、并最終得出“溶解氧是影響PC2軸（代表理化性質(zhì)驅(qū)動(dòng)毒性）的關(guān)鍵變量”這一結(jié)論的基礎(chǔ)。沒有這些準(zhǔn)確的溶解氧測(cè)量值，PCA中第二主成分的生物學(xué)意義將難以闡釋。

 

區(qū)分混雜因素，提高毒性歸因的準(zhǔn)確性：通過持續(xù)監(jiān)測(cè)溶解氧，研究者能夠?qū)⒂扇毖跻鸬姆翘禺愋远拘孕?yīng)與由污染物引起的特異性毒性效應(yīng)區(qū)分開來。這使得他們能夠更準(zhǔn)確地判斷，觀察到的某種畸形（例如心血管異常）究竟是主要源于沉積物中存在的特定污染物，還是主要源于沉積物基質(zhì)造成的缺氧環(huán)境。這種區(qū)分能力對(duì)于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估至關(guān)重要，因?yàn)獒槍?duì)這兩種不同原因的管理和修復(fù)策略是完全不同的。

 

綜上所述，丹麥Unisense氧微電極在本研究中并非用于產(chǎn)生前沿的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，而是作為一項(xiàng)精密的質(zhì)控和診斷工具。它通過提供準(zhǔn)確、連續(xù)的溶解氧數(shù)據(jù)，為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的可靠性奠定了基礎(chǔ)，并為核心科學(xué)結(jié)論——即沉積物理化性質(zhì)（通過引起缺氧）是獨(dú)立于化學(xué)污染的重要毒性驅(qū)動(dòng)因素——提供了關(guān)鍵且令人信服的證據(jù)。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用凸顯了在高品質(zhì)環(huán)境毒理學(xué)研究中，對(duì)暴露條件進(jìn)行精細(xì)監(jiān)控的重要性。