A Study of the Microbial Spatial Heterogeneity of Bahamian Thrombolites Using Molecular, Biochemical, and Stable Isotope Analyses

應用分子生物學方法研究巴哈馬血栓的微生物空間異質性及其穩定同位素分析

來源：ASTROBIOLOGY Volume 17, Number 5, 2017

 

論文摘要

本論文摘要指出，血栓巖是一種具有凝塊狀內部結構的碳酸鹽建造物，由微生物墊與環境的相互作用形成。盡管研究已有進展，但我們對其形成的微生物和分子過程仍知之甚少。本研究通過結合16S rRNA基因測序、預測宏基因組學、微電極剖面分析和原位穩定同位素分析，對巴哈馬高博恩島（Highborne Cay）血栓巖形成墊的微生物和代謝多樣性進行了空間剖面式研究。分析揭示了血栓巖形成墊內存在三個不同的空間區域，這些區域具有分層分布的細菌和古菌種群。預測宏基因組學還揭示了墊內代謝功能（如光合作用、羧酸和脂肪酸合成）的垂直分布，這是此前未被觀察到的。血栓巖形成墊內的碳酸鹽沉淀物顯示出同位素地球化學特征，表明巴哈馬血栓巖中的沉淀作用是光合作用誘導的。本研究首次揭示了巴哈馬血栓巖內微生物種群的空間組織情況，并將微生物的分布與其在現代血栓巖系統內的活動關聯起來。

研究目的

本研究的主要目的在于：

 

揭示微生物群落的空間分層結構：探究在形成凝塊狀結構（而非層狀）的血栓巖微生物墊中，細菌和古菌的種群在垂直空間上是否以及如何分層分布。

闡明分層的代謝功能：在物種分布的基礎上，進一步研究不同空間區域的潛在代謝功能（如碳、硫、氮循環）是否存在差異，從而將群落結構與生態系統功能聯系起來。

確定碳酸鹽沉淀的主要驅動機制：通過高分辨率的穩定同位素分析，探尋血栓巖中碳酸鹽沉淀的地球化學信號，以判斷是光合作用還是其他代謝過程（如硫酸鹽還原）是主要的沉淀驅動力。

 

建立多學科方法聯用范例：展示如何將分子生物學技術（基因測序）、生物地球化學測量（微電極）和地球化學分析（穩定同位素）相結合，從而對復雜微生物生態系統（如微生物巖）獲得更全面、更機制性的理解。

 

研究思路

本研究采用了“空間分層 - 多技術聯用 - 數據整合”的系統思路：

 

現場采樣與空間分區：在巴哈馬高博恩島的潮間帶采集活躍生長的血栓巖“按鈕狀”微生物墊。首先使用丹麥Unisense微電極測量沉積物-水界面以下的溶解氧（O?）、硫化氫（H?S）和pH的垂直剖面（圖1C）。根據這些地球化學梯度，將墊子劃分為三個明確的區域：Zone 1（0-3 mm，氧化區）、Zone 2（3-5 mm，過渡區）和Zone 3（5-9 mm，缺氧區）（圖1D）。

 

微生物群落結構分析：使用無菌解剖刀將微生物墊按上述三個區域物理分割。對每個區域的樣品進行16S rRNA基因擴增子測序，分析細菌和古菌的群落組成和多樣性，從而揭示微生物種群的空間分布（圖2，3，4，5）。

 

 

 

 

代謝功能預測：基于16S rRNA基因測序得到的分類學信息，使用PICRUSt算法預測每個區域微生物群落的功能基因組成（預測宏基因組），并與已發表的血栓巖鳥槍法宏基因組數據進行比較，以推斷潛在代謝能力的空間差異（圖6）。

 

地球化學機制探究：通過體相穩定同位素分析和二次離子質譜（SIMS）這兩種技術，對血栓巖中鈣化的絲狀藍細菌（Dichothrix sp.）及周圍碳酸鹽沉積物進行碳（δ13C）、氧（δ1?O）同位素分析（圖7，8）。SIMS技術提供了微米級的空間分辨率，能夠區分絲狀體本身和周圍基質的同位素信號，從而更精確地指示形成時的微環境。

 

 

 

數據關聯與模型構建：將微生物組成、預測代謝功能、地球化學梯度（微電極）和同位素信號進行整合關聯，構建一個綜合模型來解釋微生物活動如何驅動血栓巖的特定空間結構和碳酸鹽沉淀。

 

測量數據及其研究意義

研究測量了多個方面的數據，其意義和來源如下（數據均引用自文檔中的圖表和文本描述）：

 

微電極剖面（界定微生物活動的物理化學背景）

 

測量指標：使用微電極測量的溶解氧（O?）、硫化氫（H?S）和pH值隨深度（從沉積物-水界面向下至9 mm）的變化剖面。圖1C展示了在光合作用高峰期（白天）和呼吸作用高峰期（夜晚）的典型剖面。

研究意義：這些數據直接、原位地揭示了血栓巖墊內強烈的、隨時間（晝夜）變化的化學梯度。這些梯度是對微生物墊進行三個區域劃分的客觀、定量依據。數據顯示，白天表層氧氣過飽和，深層有H?S積累，表明存在強烈的好氧和厭氧代謝活動。這些梯度是理解微生物分層分布和代謝功能的物理化學基礎。

 

數據來源：圖1C。

 

微生物16S rRNA基因序列（揭示群落結構組成與多樣性）

 

測量指標：對三個分區樣品進行測序，獲得的操作分類單元（OTUs）、物種分類學組成（門、綱、目、科水平）以及香農指數等α多樣性指標。表1提供了各區域的序列數量、OTU數和多樣性指數摘要。圖2、3、4、5展示了細菌和古菌在不同分類水平上的相對豐度分布。

研究意義：數據清楚地表明，細菌和古菌的群落結構在三個區域之間存在顯著差異（圖4A，B）。例如，Zone 1（氧化區）富集絲狀藍細菌（Rivulariaceae科）和光合異養菌（Rhodobacterales等）；而Zone 3（缺氧區）則富集硫酸鹽還原菌（Desulfobacteraceae）和甲烷菌。這首次在物種水平上證實了血栓巖微生物墊存在高度的空間異質性，挑戰了其內部結構均一的觀點。

 

數據來源：表1， 圖2（藍細菌）， 圖3（細菌）， 圖4（主坐標分析）， 圖5（古菌）。

 

預測宏基因組學數據（推斷潛在代謝功能的空間分布）

 

測量指標：基于PICRUSt算法預測的KEGG通路（KO Level 3）在各區域的相對豐度。圖6展示了預測結果與實測鳥槍法宏基因組的比較。

研究意義：預測結果顯示，與光合作用、卟啉和葉綠素代謝相關的基因在Zone 1顯著富集，而與脂肪酸代謝和脂多糖生物合成相關的基因在Zone 2和3更豐富。這將微生物的群落結構與它們可能執行的代謝功能在空間上聯系起來，表明不同區域的微生物扮演著不同的生態角色，共同驅動了整個墊子的生物地球化學循環。

 

數據來源：圖6。

 

穩定同位素數據（追溯碳酸鹽沉淀的機制）

 

測量指標：鈣化絲狀體及周圍沉積物的碳（δ13C）和氧（δ1?O）穩定同位素組成，分別通過體相分析和高分辨率的二次離子質譜（SIMS）獲得。圖7展示了同位素值的分布，圖8顯示了SIMS分析的靶點位置。

研究意義：SIMS分析顯示，鈣化絲狀體本身的δ13C值顯著偏正（最高達+5.5‰），且高于周圍沉積物的值。極高的δ13C值是光合作用吸收輕同位素（12C）的CO?，導致周圍環境重同位素（13C）富集，從而引發碳酸鹽沉淀的典型標志。這一發現強有力地證明了光合作用是驅動血栓巖中碳酸鹽沉淀的主要機制，而非硫酸鹽還原等其他途徑。

 

數據來源：圖7， 圖8。

 

研究結論

 

血栓巖微生物墊具有高度結構化的微生物群落：研究證實，盡管血栓巖呈現凝塊狀宏觀結構，但其內部的微生物墊在毫米尺度上存在清晰的化學梯度（O?, H?S, pH）和顯著的微生物群落分層。好氧、兼性厭氧和嚴格厭氧的微生物類群在空間上被分隔開來，各占據有利的生態位。

代謝功能與空間位置緊密耦合：預測宏基因組學分析表明，微生物的代謝潛能與其所在的空間位置高度相關。光合作用相關基因富集于表層（Zone 1），而發酵、硫酸鹽還原等厭氧代謝基因在深層（Zone 2, 3）更活躍。這種功能分區是微生物墊高效進行物質和能量循環的基礎。

光合作用是碳酸鹽沉淀的主要驅動力：高分辨率穩定同位素數據（特別是SIMS數據）提供了迄今為止最直接的證據，表明血栓巖中的碳酸鹽沉淀主要是由藍細菌等光合自養生物的活動驅動的。光合作用消耗CO?，導致局部pH值升高、碳酸鹽飽和度增加，從而促使碳酸鈣（文石）沉淀。

 

提出了一個綜合的形成模型：研究整合所有數據，描繪出血栓巖形成的圖景：表層藍細菌通過光合作用固定碳并創造堿性微環境，誘導碳酸鹽沉淀；同時，它們的生長和代謝活動為下層輸送有機物，支持了豐富的厭氧微生物群落（如硫酸鹽還原菌）；這些好氧和厭氧過程的耦合與空間分離，共同塑造了血栓巖獨特的凝塊狀結構。

 

丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統是成功實現微生物墊空間分區、并將其與生物學過程關聯起來的關鍵工具和實驗起點，其研究意義至關重要：

 

提供了定義生態分區的高分辨率地球化學基準：Unisense微電極能夠以極高的空間分辨率（250 μm間隔）測量O?, H?S, pH等關鍵化學參數的原位垂直剖面。這種毫米/亞毫米級的測量精度，使得研究者能夠客觀、精確地識別出微生物墊中氧化層（Zone 1）、過渡層（Zone 2）和缺氧層（Zone 3）的邊界（圖1C, D）。沒有這種高分辨率的地球化學剖面，后續的物理分割和分子分析就缺乏可靠的依據，分區可能變得主觀或模糊。

實時揭示了微生物代謝活動的強烈晝夜動態：微電極測量不僅在單一時間點進行，還對比了白天（光合作用高峰）和夜晚（呼吸作用高峰）的化學剖面。數據顯示，O?和pH在白天顯著升高，H?S在夜晚積累并向表層遷移。這動態地展示了整個微生物墊作為一個“超級生物”的代謝節律，證明了光合作用和呼吸/還原過程是驅動其內部環境晝夜交替的核心力量。這種時間動態數據是理解微生物適應和相互作用的重要背景。

將微生物分布與微環境條件直接關聯：通過將微電極確定的化學梯度與后續分子分析得到的微生物分布圖疊加，研究者能夠直接將特定的微生物類群與其偏好的生存環境（如好氧、微好氧、厭氧）聯系起來。例如，絲狀藍細菌（Rivulariaceae）在O?過飽和的Zone 1占主導，而硫酸鹽還原菌（Desulfobacteraceae）在H?S出現的Zone 3富集。這為解釋“為什么某種微生物會出現在某個位置”提供了最直接的物化解釋，增強了群落生態學解釋的說服力。

為穩定同位素解釋提供了關鍵的上下文信息：微電極測得的極高pH值（白天可達10.4）為穩定同位素數據（δ13C偏正）的解釋提供了佐證。高pH環境會促使溶解的無機碳體系向CO?2?轉化，這本身就有利于碳酸鹽沉淀。同時，在強光合作用和高pH的協同作用下，碳酸鹽沉淀時的同位素分餾效應會更加顯著，導致沉淀物具有更重的δ13C值。微電極數據為同位素的“光合作用驅動”解釋提供了獨立的、支持性的環境證據。

 

驗證了分區的生物學相關性：最終，基于微電極數據的分區方案，被隨后的分子數據（群落結構顯著不同，圖4）和功能預測數據（代謝通路富集不同，圖6）所驗證。這證明了由微電極揭示的物理化學梯度確實塑造了截然不同的微生物棲息地，并且這些棲息地承載著不同的生態系統功能。因此，微電極不僅是劃分工具，更是連接非生物環境與生物群落的核心橋梁。

 

綜上所述，丹麥Unisense微電極在本研究中扮演了“環境偵探”和“空間制圖師”的角色。其提供的高分辨率、原位、實時化學剖面，是構建整個研究框架的基石。沒有這項技術，對血栓巖微生物墊空間異質性的研究將難以超越宏觀描述，而無法深入到機制性的、將微生物與其物理化學微環境緊密關聯的層面。因此，該技術的應用是成功實現從“描述有什么”到“解釋為什么在那里”這一跨越的根本前提。