Sensing oxygen at the millisecond time-scale using an ultra-microelectrode array (UMEA)

利用超微電極陣列對氧進行毫秒級的傳感

來源：Sensors and Actuators B 238 (2017) 1008–1016

 

一、論文摘要

本研究報道了一種新穎的傳感協(xié)議，該協(xié)議基于超短時間測量（<5毫秒），并采用一種專用的超微電極陣列（UMEA）傳感器，用于監(jiān)測溶液中的溶解氧濃度。該UMEA傳感器由鉑（Pt）制成，以氧化物-氮化物-氧化物（ONO）作為絕緣材料，電極凹嵌在玻璃基底中。傳感器在其線性區(qū)域內(nèi)工作，溶液中的氧濃度可在不到5毫秒內(nèi)從測得的電流（I）與時間的平方根倒數(shù)（1/√t）關(guān)系曲線的斜率中推導(dǎo)出來。為驗證所提出的測量協(xié)議并校準(zhǔn)傳感器，在一個10毫升的濕池中，使用UMEA傳感器和一個外部的電化學(xué)傳感器同步監(jiān)測溶解氧濃度的變化。兩種傳感器的測量結(jié)果表現(xiàn)出極好的一致性（R2 = 0.994），并確定UMEA傳感器在此超短測量模式下的靈敏度為0.49 nA·s??.? / mg/L。最終，也是最重要的一點，在這種配置下進行電化學(xué)測量所消耗的氧氣量被極大地減少了，與商用電化學(xué)傳感器相比減少了約10個數(shù)量級，這對于在微流控系統(tǒng)中原位監(jiān)測納升級體積內(nèi)微組織（如細(xì)胞團）的呼吸活性具有極高價值。

二、研究目的

本研究旨在解決在微流控系統(tǒng)等極小體積環(huán)境中進行實時、原位氧濃度監(jiān)測時面臨的核心挑戰(zhàn)：傳統(tǒng)氧傳感器因測量過程自身消耗氧氣過多，會嚴(yán)重干擾被測生物樣本（如細(xì)胞、微組織）的生存微環(huán)境。具體目標(biāo)包括：

 

開發(fā)一種超低耗氧的氧傳感技術(shù)：通過結(jié)合超微電極陣列（UMEA）和超短時間測量協(xié)議（毫秒級），從根本上減少單次測量所消耗的氧氣量，避免對納升級樣本的氧環(huán)境造成顯著擾動。

驗證超短時間測量協(xié)議的可行性：探索在非穩(wěn)態(tài)擴散的線性區(qū)域（Cottrell區(qū)）進行測量的可能性，并建立從電流-時間數(shù)據(jù)中快速提取氧濃度的校準(zhǔn)方法。

全面表征傳感器性能：對自制UMEA傳感器進行物理表征（尺寸、形貌）和電化學(xué)表征，確保其符合理論模型，并評估其靈敏度、線性度和重現(xiàn)性。

 

展示技術(shù)在微流控應(yīng)用中的潛力：通過證明其極低的氧氣消耗和快速響應(yīng)能力，為該技術(shù)最終集成到微流控設(shè)備中，用于長期、無損地監(jiān)測微量生物樣本的代謝活動奠定基礎(chǔ)。

 

三、研究思路

研究遵循了從理論設(shè)計 -> 傳感器制備 -> 性能表征 -> 協(xié)議驗證的系統(tǒng)性思路：

 

理論設(shè)計與傳感器設(shè)計：基于微電極擴散理論，設(shè)計一種電極間距足夠大、且凹嵌在基底中的UMEA結(jié)構(gòu)。這種設(shè)計旨在確保在毫秒級測量時間內(nèi)，每個微電極的擴散場保持獨立且呈平面擴散，從而使總電流遵循Cottrell方程（電流 I ∝ 1/√t），并極大縮短達到穩(wěn)態(tài)擴散所需的時間。傳感器集成了工作電極（UMEA）、對電極和參比電極。

傳感器制備與優(yōu)化：采用標(biāo)準(zhǔn)的微加工技術(shù)（光刻、濺射、lift-off、反應(yīng)離子刻蝕等）在玻璃基底上制備Pt UMEA傳感器。針對初期工藝中出現(xiàn)的電極開口不徹底、絕緣層剝離等問題，優(yōu)化了工藝流程，包括增加鈦粘附層、將電極凹嵌以及引入Piranha溶液和HF的后期處理步驟以徹底清潔和打開Pt電極表面。

物理與電化學(xué)表征：

 

物理表征：使用原子力顯微鏡（AFM）和掃描電子顯微鏡（SEM）精確測量UMEA中每個微電極的實際直徑（~2.09 μm）和凹嵌深度（~390 nm），為理論計算提供準(zhǔn)確參數(shù)。

 

電化學(xué)表征：使用鐵氰化鉀作為模型氧化還原對，通過循環(huán)伏安法（CV）驗證傳感器的穩(wěn)態(tài)行為，并將實驗測得的穩(wěn)態(tài)電流與理論值比較，以確認(rèn)所有微電極均已正確打開且功能正常。

 

氧傳感協(xié)議開發(fā)與驗證：

 

確定工作電位：通過CV在含氧和無氧溶液中確定氧還原的最佳工作電位（-0.2 V vs. Ag/AgCl）。

實施超短時測量：在確定的電位下施加10毫秒的脈沖，但僅采集前5毫秒的電流數(shù)據(jù)（采樣率24 μs），以確保測量在擴散的線性區(qū)內(nèi)進行。

數(shù)據(jù)解析：將采集的電流數(shù)據(jù)對1/√t作圖，取其線性區(qū)域的斜率作為傳感器響應(yīng)值，該斜率與氧濃度成正比。

 

同步校準(zhǔn)與驗證：在進行UMEA測量的同時，使用一個商用的、經(jīng)過校準(zhǔn)的Unisense微Clark氧電極同步、獨立地測量溶液中的絕對氧濃度，從而建立UMEA傳感器響應(yīng)值與真實氧濃度之間的校準(zhǔn)曲線，并驗證其準(zhǔn)確性。

 

四、測量數(shù)據(jù)、研究意義及來源

研究者測量了多個層面的數(shù)據(jù)，其意義和來源如下：

 

UMEA傳感器的物理尺寸（直徑、凹嵌深度）：通過AFM和SEM測量。

 

研究意義：這是所有理論計算和性能預(yù)測的基礎(chǔ)。精確的幾何尺寸對于計算理論穩(wěn)態(tài)電流、判斷擴散場是否重疊以及確定線性測量時間窗口至關(guān)重要。數(shù)據(jù)顯示制備的傳感器與設(shè)計規(guī)格高度一致（文檔圖3及其對應(yīng)描述），證明了微加工工藝的可靠性和可控性，確保了后續(xù)電化學(xué)測試結(jié)果的可解釋性。

 

數(shù)據(jù)來源：UMEA傳感器的整體結(jié)構(gòu)和單個微電極的SEM圖像展示在 文檔圖3中。AFM和SEM測量的具體尺寸數(shù)據(jù)在論文正文的“4.2. Physical characterization of the UMEA”部分給出。

 

鐵氰化鉀中的循環(huán)伏安曲線和穩(wěn)態(tài)電流：使用不同濃度鐵氰化鉀溶液測試傳感器的CV行為。

 

研究意義：用于驗證UMEA傳感器的基本電化學(xué)功能是否正常，并確認(rèn)其具有微電極的典型特征（呈S形的穩(wěn)態(tài)伏安曲線）。穩(wěn)態(tài)電流與鐵氰化鉀濃度（文檔圖4A, B）以及傳感器中微電極數(shù)量（文檔圖4C, D）的線性關(guān)系，強有力地證明了傳感器按設(shè)計工作，每個微電極獨立貢獻，且制備成功率高。實驗值與理論值的良好吻合（誤差<10%）進一步證實了這一點。

 

 

數(shù)據(jù)來源：不同濃度鐵氰化鉀下的CV曲線以及穩(wěn)態(tài)電流與濃度/微電極數(shù)量的關(guān)系圖展示在 文檔圖4中。具體的實驗與理論電流值對比列于 文檔中表1。

 

氧還原的循環(huán)伏安曲線：在含氧和無氧溶液中掃描CV。

 

研究意義：用于確定進行氧還原反應(yīng)的最佳工作電位。CV曲線（文檔圖5A）清晰顯示在-0.4 V至0.1 V（vs. Ag/AgCl）電位區(qū)間內(nèi)有明顯的氧還原電流，從而幫助研究者選擇-0.2 V作為后續(xù)計時安培測量的固定電位，以在保證靈敏度的同時盡量避免析氫等副反應(yīng)。

 

數(shù)據(jù)來源：在空氣飽和及缺氧溶液中的CV曲線展示在 文檔圖5A中。

 

超短時測量下的原始電流-時間數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)換后的I vs. 1/√t圖：在氧濃度變化過程中，記錄毫秒級的電流瞬態(tài)響應(yīng)。

 

研究意義：這是超短時測量協(xié)議的核心數(shù)據(jù)。原始的電流-時間曲線（文檔圖5B）和轉(zhuǎn)換后的I vs. 1/√t圖（文檔圖5C, D）直觀展示了傳感器在毫秒尺度的響應(yīng)。在1.1至4.4毫秒?yún)^(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)的良好線性關(guān)系，直接驗證了在該時間窗口內(nèi)擴散確實處于平面線性擴散模式（Cottrell區(qū)），從而證明了該測量協(xié)議的物理基礎(chǔ)是成立的。這是能夠從斜率快速計算氧濃度的前提。

 

數(shù)據(jù)來源：不同氧濃度下的計時安培曲線（I-t）及其轉(zhuǎn)換后的I vs. 1/√t圖展示在 文檔圖5B, C, D中。

 

UMEA傳感器響應(yīng)值與Unisense測得的氧濃度的校準(zhǔn)曲線：將UMEA的斜率響應(yīng)值與同步測量的絕對氧濃度進行關(guān)聯(lián)。

 

研究意義：這是將UMEA的原始電信號轉(zhuǎn)化為精確氧濃度值的最終、也是最重要的一步。得到的高度線性（R2 = 0.994）且連續(xù)三天可重復(fù)的校準(zhǔn)曲線（文檔圖5E），無可辯駁地證明了這種超短時測量協(xié)議的整體準(zhǔn)確性和可靠性。它表明，即使在毫秒級時間內(nèi)，UMEA傳感器也能穩(wěn)定、準(zhǔn)確地量化溶解氧濃度。

 

數(shù)據(jù)來源：UMEA傳感器響應(yīng)值（斜率）與由Unisense電極測得的氧濃度之間的校準(zhǔn)曲線展示在 文檔圖5E中。

 

五、研究結(jié)論

 

成功開發(fā)并驗證了一種超快、超低耗氧的氧傳感方案：研究證實，將定制化的UMEA傳感器與小于5毫秒的超短時測量協(xié)議相結(jié)合，可以實現(xiàn)對溶解氧濃度的精確測量，同時將測量過程本身的氧氣消耗量降至飛摩爾級別。

理論預(yù)測與實驗結(jié)果高度吻合：傳感器對鐵氰化鉀的響應(yīng)電流與基于其精確物理尺寸的理論計算值高度一致，證明了傳感器設(shè)計的合理性和制備工藝的精確性。在氧測量中，傳感器響應(yīng)在毫秒時間內(nèi)確實遵循Cottrell方程，驗證了超短時測量協(xié)議的理論基礎(chǔ)。

耗氧量實現(xiàn)了數(shù)量級的降低：計算表明，單次測量耗氧量僅約63 fmol，相對于10 mL溶液，氧濃度變化僅約10??%。與商用Unisense Clark電極相比，耗氧量降低了約10個數(shù)量級。這是該技術(shù)最核心的優(yōu)勢。

 

為微流控生物應(yīng)用鋪平道路：這種可忽略不計的耗氧和毫秒級的快速測量能力，使得該技術(shù)非常適合集成到納升體積的微流控芯片中，用于長期、原位、實時地監(jiān)測細(xì)胞、胚胎或微組織等微量生物樣本的呼吸代謝活性，而不會對樣本的生存環(huán)境造成干擾。

 

六、使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義詳解

在本研究中，丹麥Unisense的OX 500微型Clark氧電極被用作一個獨立的、經(jīng)過校準(zhǔn)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”參考傳感器，在10 mL的濕池實驗中同步、連續(xù)地監(jiān)測溶液的絕對溶解氧濃度。

其研究意義是根本性的，是驗證本研究核心創(chuàng)新點——超短時測量協(xié)議的準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵參照系，具體體現(xiàn)在：

 

提供了無可爭議的濃度基準(zhǔn)：UMEA傳感器在超短時測量中提供的是一個相對的電流信號（斜率）。這個信號本身無法直接給出氧濃度的絕對值。Unisense電極作為一個成熟、商用的標(biāo)準(zhǔn)傳感器，其測量結(jié)果被廣泛認(rèn)可。通過同步測量，研究者可以將UMEA的相對響應(yīng)信號與Unisense測得的絕對氧濃度值一一對應(yīng)起來（文檔圖5E）。沒有Unisense電極提供的這個基準(zhǔn)，UMEA傳感器的讀數(shù)將無法被校準(zhǔn)，其測量結(jié)果的真實性也無從驗證。

實現(xiàn)了對UMEA傳感器性能的定量評估：通過繪制校準(zhǔn)曲線，研究者可以定量地計算出UMEA傳感器的靈敏度（0.49 nA·s??.? / mg/L）、線性范圍（R2 = 0.994）和日間重現(xiàn)性。這些關(guān)鍵的性能指標(biāo)完全依賴于Unisense電極所提供的準(zhǔn)確濃度值。Unisense電極在這里扮演了“計量標(biāo)準(zhǔn)器”的角色，使得UMEA傳感器的性能可以被客觀、量化地評價。

為“低耗氧”這一核心優(yōu)勢提供了對比基準(zhǔn)：論文中提到的“耗氧量降低10個數(shù)量級”這一驚人結(jié)論，是通過與Unisense這類商用電化學(xué)傳感器的典型耗氧量進行對比得出的。Unisense電極的性能參數(shù)作為一個公認(rèn)的參考點，極大地凸顯了本研究提出的新技術(shù)在“最小化測量干擾”方面的巨大突破和優(yōu)勢。

 

增強了研究成果的可信度：使用一個獨立的、商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)儀器進行驗證，而不是僅僅依賴?yán)碚撚嬎慊蜃陨硐到y(tǒng)的閉環(huán)比較，極大地增強了實驗結(jié)論的可信度和說服力。它向讀者表明，UMEA的超短時測量協(xié)議得到了一種外部、成熟技術(shù)的支持，避免了可能存在的自我驗證偏差。

 

總結(jié)：丹麥Unisense氧電極在本研究中扮演了 “精確測量的錨點”和“性能驗證的裁判”的角色。它提供的連續(xù)、可靠的絕對氧濃度數(shù)據(jù)，是將UMEA傳感器的原始電信號轉(zhuǎn)化為有物理意義的化學(xué)信息，并最終證明其超快、超低耗氧測量能力的基石。沒有Unisense電極作為外部標(biāo)準(zhǔn)，本研究將無法令人信服地證實其新測量協(xié)議的準(zhǔn)確性，其核心創(chuàng)新價值也會大打折扣。因此，Unisense電極的貢獻在于為確保該研究的科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性和結(jié)論的可靠性提供了不可或缺的、權(quán)威的第三方驗證。