Structural and functional characterization of the hydrogenase-maturation HydF protein

氫化酶成熟蛋白 HydF 的結構與功能特性分析

來源：nature CHEMICAL BIOLOGY | VOL 13 | JULY 2017

 

論文摘要總結

本文報道了對氫酶成熟蛋白HydF的結構與功能表征。HydF是[FeFe]氫酶成熟過程中的關鍵支架蛋白，負責組裝2Fe亞簇前體并將其轉移至氫酶。研究首次解析了來源于Thermosipho melanesiensis的HydF蛋白（TmeHydF）與其[4Fe-4S]簇結合的X射線晶體結構（分辨率2.8 ?）。該簇由三個保守的半胱氨酸和一個可交換的谷氨酸（Glu305）配位。研究證實，合成的2Fe亞簇類似物[Fe?(adt)(CO)?(CN)?]2?（化合物1）可與HydF結合形成雜交蛋白（1-HydF），并能有效成熟氫酶。其FTIR光譜與天然宿主中純化的HydF活性中間體高度相似，表明1可能是真實的2Fe前體。此外，化學修飾的HydF（2-HydF）表現出氫酶活性，為開發人工氫酶提供了新途徑。

研究目的

本研究旨在解決以下關鍵問題：

 

解析HydF的精細結構：闡明其[4Fe-4S]簇的配位模式（長期存在爭議），明確其作為支架蛋白的結構基礎。

揭示2Fe亞簇組裝機制：探究HydF如何結合由HydE和HydG合成的配體（如adt2?、CO、CN?），并組裝成2Fe前體。

驗證合成類似物的功能性：評估化合物1和2（含pdt2?配體）能否模擬天然中間體，并研究其成熟氫酶的能力。

 

探索人工氫酶潛力：通過構建HydF-合成復合物雜交體，測試其直接催化產氫的活性。

 

研究思路

 

蛋白質制備與重構：

 

選擇嗜熱菌T. melanesiensis的HydF進行異源表達，通過加熱和凝膠過濾純化獲得脫輔基蛋白（apo-HydF）。

 

在嚴格厭氧條件下，利用鐵銨鹽、L-半胱氨酸和脫硫酶CsdA重構[4Fe-4S]簇，獲得全酶（FeS-TmeHydF）。

 

結構解析與表征：

 

通過X射線晶體學解析FeS-TmeHydF的三維結構，利用反常散射確定簇的位置。

 

使用UV-Vis光譜、EPR、HYSCORE和FTIR光譜表征簇的電子性質和配體環境。

 

功能驗證：

 

將化合物1或2與FeS-TmeHydF孵育制備雜交蛋白，通過鐵定量、FTIR和HYSCORE驗證結合。

測試雜交蛋白對Megasphaera elsdenii氫酶（HydA）的成熟效率（通過二硫化物-甲基紫精法和氣相色譜檢測H?產量）。

 

使用丹麥Unisense氫微傳感器直接測量2-HydF雜交體的產氫活性。

 

突變體驗證：構建E305H和E305C突變體，評估Glu305在簇配位和2Fe復合物結合中的關鍵作用。

 

測量數據及研究意義

 

晶體結構數據（來自圖2b-d）：

 

數據內容：顯示[4Fe-4S]簇由Cys298、Cys349、Cys352和Glu305配位；簇暴露于溶劑，鄰近帶正電的空腔可能用于結合2Fe前體。

 

研究意義：首次明確HydF簇的配位模式，顛覆了此前關于組氨酸或水分子作為第四配體的假設；Glu305的可交換性為前體結合提供了結構靈活性。

 

HYSCORE光譜數據（來自圖3）：

 

數據內容：加入咪唑后，在(5.5, 2.4) MHz處出現雙量子特征峰，表明咪唑取代了Glu305與簇結合。

 

研究意義：直接證明Glu305的配位具有可交換性，支持其在2Fe前體結合中的調節作用。

 

FTIR光譜數據（來自圖4）：

 

數據內容：1-TmeHydF和2-TmeHydF在1,800–2,100 cm?1范圍內顯示尖銳的C-O和C-N伸縮振動峰，與天然HydF中間體光譜高度相似。

 

研究意義：證實合成復合物在蛋白環境中保持完整性，且1可能是天然2Fe前體的準確模擬物。

 

氫酶活性數據（來自圖5）：

 

數據內容：2-TmeHydF的產氫轉換頻率（TOF）為0.3 min?1，比游離化合物2高30倍，但比成熟氫酶（2-HydA）低20–30倍。

 

研究意義：首次證明化學修飾的HydF可直接催化產氫，為構建人工氫酶提供了概念驗證。

 

突變體數據（來自補充圖13-15）：

 

數據內容：E305H和E305C突變體難以結合化合物1或2，且簇重構效率降低。

 

研究意義：凸顯Glu305在維持簇穩定性及2Fe前體結合中的不可替代性。

 

結論

 

結構創新：HydF的[4Fe-4S]簇由三半胱氨酸一谷氨酸配位，Glu305的可交換性為2Fe前體結合提供了動態機制。

功能模擬：化合物1是天然2Fe前體的理想模擬物，其與HydF形成的雜交體能高效成熟氫酶。

人工酶潛力：2-HydF雜交體具有直接產氫活性，雖效率低于天然氫酶，但為理性設計人工催化劑奠定了基礎。

 

進化意義：Glu305在98%的細菌HydF中保守，表明該配位模式在進化中具有優勢。

 

詳細解讀使用丹麥Unisense電極測量數據的意義

丹麥Unisense氫微傳感器在本研究中用于直接檢測溶液中的氫氣濃度，其測量數據的意義如下：

 

高靈敏度檢測低活性系統：

 

數據關聯：圖5a顯示2-TmeHydF的TOF僅0.3 min?1，而傳統氣相色譜法難以檢測如此低活性。Unisense電極的檢測限極低（可測nM級H?），成功捕獲了雜交體的微弱產氫信號。

 

研究意義：避免了放射性標記或間接化學法的復雜性，為低活性人工酶系統的功能評估提供了可靠工具。

 

實時動力學監測：

 

數據關聯：圖5b顯示產氫反應在加入連二亞硫酸鈉后立即開始，并在數分鐘內達到平臺期。

 

研究意義：電極的時間分辨率（1秒/點）揭示了2-HydF的催化啟動速度及穩定性缺陷（活性快速衰減），為優化催化劑壽命提供了關鍵參數。

 

定量比較活性差異：

 

數據關聯：通過校準曲線將電流信號轉換為H?濃度，精確量化了2-HydF（TOF=0.3 min?1）、游離化合物2（TOF=0.01 min?1）和成熟2-HydA（TOF=10 min?1）的活性差異。

 

研究意義：明確證實蛋白環境對合成復合物的催化增強作用（30倍），凸顯了支架蛋白在促進催化中的關鍵角色。

 

支持人工氫酶開發：

 

技術優勢：Unisense電極無需采樣、可實時監測微升體積樣品，特別適合高通量篩選突變體或條件優化。

 

應用延伸：該技術可直接應用于自然水體或生物膜系統中的氫代謝研究，為人工光合作用系統的原位評估提供了方法學支持。

 

綜上，Unisense電極的數據不僅驗證了HydF雜交體的催化功能，還通過高靈敏度實時監測為人工酶的性能優化提供了不可或缺的量化依據。