Molecular hydrogen protects against oxidative stress-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell death through the process of mitohormesis

分子氫通過(guò)線粒體興奮效應(yīng)過(guò)程保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡

來(lái)源：PLoS ONE, Volume 12, Issue 5, Article e0176992, 2017

論文的英文來(lái)源翻譯成中文

《公共科學(xué)圖書(shū)館·綜合》，第12卷，第5期，文章編號(hào)e0176992，2017年

 

摘要

吸入分子氫氣體可改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的急性腦損傷。飲用近飽和氫水也能在動(dòng)物和臨床研究中預(yù)防包括帕金森病在內(nèi)的慢性神經(jīng)退行性疾病。然而，少量H2產(chǎn)生顯著效應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。本研究探討了H2對(duì)培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中線粒體的影響。H2增加了線粒體膜電位和細(xì)胞ATP水平，同時(shí)伴隨著還原型谷胱甘肽水平的降低和超氧化物水平的升高。用H2預(yù)處理可抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而事后處理則無(wú)效。H2處理細(xì)胞中Nrf2通路下游抗氧化酶表達(dá)的增加表明，H2引起的輕度應(yīng)激增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)加劇的氧化應(yīng)激的抵抗力。我們提出H2在細(xì)胞中既作為自由基清除劑，又作為對(duì)抗氧化應(yīng)激的線粒體興奮效應(yīng)劑。

 

研究目的

本研究的主要目的是闡明分子氫保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制。具體來(lái)說(shuō)，是研究H2是否通過(guò)影響線粒體功能并引發(fā)一種稱為"mitohormesis"（線粒體興奮效應(yīng)）的適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用。

 

研究思路

研究思路是建立一個(gè)嚴(yán)格控制氣體環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使用含有50% H2的混合氣體處理SH-SY5Y細(xì)胞。通過(guò)比較H2預(yù)處理和事后處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，來(lái)確定H2的保護(hù)作用模式。然后，系統(tǒng)評(píng)估H2處理對(duì)線粒體功能（膜電位、ATP產(chǎn)生、耗氧率）、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)（谷胱甘肽水平、超氧化物、ROS）以及抗氧化防御系統(tǒng)（Nrf2通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)）的影響，從而探究H2發(fā)揮保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1.  細(xì)胞存活率：通過(guò)WST-1法和活/死細(xì)胞染色試劑盒評(píng)估。數(shù)據(jù)主要展示在Figure 2中。研究意義：這直接證明了H2預(yù)處理（而非事后處理）能劑量依賴性和時(shí)間依賴性地保護(hù)細(xì)胞免受H2O2毒性，提示其作用機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性預(yù)適應(yīng)，而非直接中和自由基。

 

2.  線粒體功能參數(shù)：包括線粒體膜電位（使用JC-1染料測(cè)量）、細(xì)胞ATP水平、氧氣消耗速率（使用高分辨率呼吸測(cè)量?jī)x）。數(shù)據(jù)展示在Figure 3中。研究意義：這些數(shù)據(jù)表明H2能增強(qiáng)線粒體的氧化磷酸化活性，提高細(xì)胞的能量代謝水平，這可能是觸發(fā)后續(xù)適應(yīng)性反應(yīng)的初始事件。

 

3.  氧化應(yīng)激指標(biāo)：包括線粒體硫醇水平（使用MitoTracker Red）、總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽水平、超氧化物水平（使用MitoSOX Red）、細(xì)胞ROS水平（使用DCFDA）。數(shù)據(jù)展示在Figure 4中。研究意義：結(jié)果表明H2處理導(dǎo)致了還原型谷胱甘肽的消耗和超氧化物水平的輕度升高，表明H2誘導(dǎo)了一種輕度的氧化應(yīng)激。這種"良性應(yīng)激"是觸發(fā)興奮效應(yīng)的重要信號(hào)。

 

4.  抗氧化防御系統(tǒng)激活指標(biāo)：包括Nrf2的核轉(zhuǎn)位（免疫熒光）、抗氧化酶（CAT, GPX1, GSR, HO-1, NQO1等）的mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）和蛋白（Western blot）表達(dá)水平。數(shù)據(jù)展示在Figure 5中。研究意義：這直接證明了H2預(yù)處理能激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)多種抗氧化酶的表達(dá)，從而建立起更強(qiáng)的細(xì)胞防御體系，以應(yīng)對(duì)后續(xù)更強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激挑戰(zhàn)。

 

5.  線粒體DNA拷貝數(shù)：通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量。數(shù)據(jù)展示在Figure 3D中。研究意義：該數(shù)據(jù)表明H2增強(qiáng)的線粒體功能并非通過(guò)增加線粒體數(shù)量實(shí)現(xiàn)，而是通過(guò)提高單個(gè)線粒體的活性。

 

結(jié)論

本研究得出的主要結(jié)論是：分子氫通過(guò)誘導(dǎo)"線粒體興奮效應(yīng)"來(lái)保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的死亡。1. H2預(yù)處理（而非事后處理）能有效保護(hù)細(xì)胞，表明其作用機(jī)制是誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)而非直接清除自由基。2. H2通過(guò)增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化活性，提高膜電位和ATP產(chǎn)量，從而引發(fā)一種輕度的氧化應(yīng)激（表現(xiàn)為GSH消耗和超氧化物輕度增加）。3. 這種輕度氧化應(yīng)激作為激活信號(hào)，觸發(fā)了Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御通路的上調(diào)，使細(xì)胞對(duì)后續(xù)更強(qiáng)烈的H2O2攻擊產(chǎn)生抵抗力。因此，H2不僅是一個(gè)選擇性抗氧化劑，更是一個(gè)線粒體興奮效應(yīng)劑。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

在本文中，使用丹麥Unisense公司特定的H2和O2微傳感器監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的氣體濃度具有關(guān)鍵的研究意義。這些電極被用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)在特定混合氣體（50% H2或?qū)φ諝怏w）環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的實(shí)際溶解濃度。研究意義在于：1. 精確控制實(shí)驗(yàn)條件：通過(guò)Unisense電極的測(cè)量，研究人員確認(rèn)在H2混合氣體環(huán)境下，培養(yǎng)基中的H2濃度穩(wěn)定維持在390±40 μM，而兩種氣體環(huán)境下的O2濃度均穩(wěn)定在120±10 μM（見(jiàn)Figure 1B）。這確保了實(shí)驗(yàn)處理的精確性和可重復(fù)性，排除了因O2濃度波動(dòng)（其本身會(huì)強(qiáng)烈影響細(xì)胞信號(hào)和命運(yùn)）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成混淆的可能性。2. 建立可靠的體外模型：精確的濃度測(cè)量使得體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的條件能夠與體內(nèi)研究（如吸入低濃度H2氣體）進(jìn)行更有意義的關(guān)聯(lián)和比較，為機(jī)制研究提供了可靠的基礎(chǔ)。3. 驗(yàn)證處理有效性：直接測(cè)量培養(yǎng)基中的溶解H2濃度，證實(shí)了細(xì)胞確實(shí)暴露于有效濃度的H2中，從而將觀察到的生物學(xué)效應(yīng)（線粒體激活、應(yīng)激反應(yīng)等）與H2處理明確關(guān)聯(lián)起來(lái)。總之，丹麥Unisense電極的應(yīng)用為本研究提供了高精度的氣體濃度定量數(shù)據(jù)，是確保實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性、可靠性和結(jié)果解讀準(zhǔn)確性的核心技術(shù)支撐，為揭示H2通過(guò)mitohormesis機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。