Searching for the low affinity ubiquinone binding site in cytochrome bo3 from Escherichia coli

在大腸桿菌細胞色素bo3中尋找低親和力泛醌結合位點

來源：Biochimica et Biophysica Acta, Volume 1858, 2017, Pages 366-370

論文的英文來源翻譯成中文

《生物化學與生物物理學報》，第1858卷，2017年，第366-370頁

 

摘要

這篇論文的摘要指出，細胞色素bo3泛醌氧化酶是大腸桿菌需氧呼吸鏈中的三種呼吸氧還原酶之一。普遍接受的催化模型假設cyt bo3含有兩個不同的泛醌結合位點：一個低親和力（QL）位點（傳統底物結合位點）和一個高親和力（QH）位點（作為輔因子的永久結合醌）。雖然QH位點已被明確界定，但QL位點的位置仍然未知。一項最近的生物信息學研究（Bossis et al., 2014）確定了一個序列基序（G163EFX3GWX2Y173）作為醌氧化酶家族中可能的QL位點。本研究通過定點誘變技術測試了這一假設，結果表明這些殘基對催化功能并不重要，也不能定義QL底物結合位點。

 

研究目的

本研究的主要目的是通過實驗驗證Bossis等人（2014）通過計算研究提出的關于細胞色素bo3中低親和力泛醌（QL）結合位點位置的理論預測。具體來說，是檢驗位于亞基I的序列基序G163EFX3GWX2Y173是否確實是QL底物結合位點。

 

研究思路

研究思路是采用分子生物學和生物化學方法對提議的QL位點基序及其附近的特定殘基進行系統性定點誘變。研究人員構建了一系列突變體，每個突變體在提議的QL基序（如E'164, F'165, Q'167, T'168, L'171, F'173）或鄰近區域（如亞基II中的WII136和EII259）內改變一個氨基酸殘基。作為對照，也在蛋白質另一側的非關鍵區域（如圖1C所示）引入了突變。然后，他們純化了這些突變體蛋白，并測量了它們使用可溶性底物泛醌-1（Q1H2）的穩態氧化酶活性。通過比較突變體與野生型酶的催化轉換率（kcat）和米氏常數（KM），可以評估這些殘基在底物結合和催化中的重要性。

 

 

測量的數據及研究意義

1.  測量的數據：研究測量了所有突變體以及野生型細胞色素bo3的穩態酶動力學參數，包括最大催化轉換率（kcat）和底物泛醌-1（Q1H2）的米氏常數（KM）。這些定量數據記錄在論文的表格1中。

 

2.  研究意義：這些動力學參數（kcat和KM）是評估酶功能的關鍵指標。kcat反映了酶的催化效率，KM反映了酶與底物的親和力。如果提議的QL基序中的殘基確實參與底物結合，那么突變這些殘基預計會導致KM值的顯著升高（親和力降低），并可能影響kcat值。通過系統比較突變體與野生型的這些參數，可以直接判斷特定殘基是否對底物結合和催化有重要貢獻。

 

 

結論

本研究得出的主要結論是：通過定點誘變和酶動力學分析，證實了由Bossis等人（2014）基于生物信息學提出的、位于細胞色素bo3亞基I的序列基序G163EFX3GWX2Y173中的殘基，對于酶的催化功能并非必需，并且不能定義低親和力泛醌（QL）底物結合位點。因為突變這些殘基后，大多數突變體的KM值（反映底物親和力）并未發生顯著變化，且多數突變體仍保留了相當高的酶活性。盡管E'164和F'165的突變導致活性有所降低，但這可能是由于它們靠近已知的QH位點而非其本身是QL位點的一部分。因此，細胞色素bo3中低親和力底物結合位點（QL）的確切位置仍然是個謎。這一發現對之前計算預測的QL位點提出了明確的反證，并指出可能需要重新審視雙位點模型，或者QL位點可能位于其他尚未探索的區域。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

在本文中，使用丹麥Unisense氧微呼吸傳感器（Oxygen MicroRespiration sensor）測量穩態泛醌-1氧化酶活性具有重要的研究意義。該電極用于實時、高靈敏度地監測反應體系中溶解氧的消耗速率。研究意義在于：1. 高精度動力學數據獲取：通過直接測量初始反應速率隨底物Q1H2濃度變化的曲線，可以準確計算出酶促反應的關鍵動力學參數kcat（轉換數）和KM（米氏常數），這是定量評估各突變體酶功能是否受損的金標準。2. 功能影響直接評估：將突變體的kcat和KM值與野生型進行比較，為判斷特定氨基酸殘基是否參與底物結合（影響KM）或催化過程（影響kcat）提供了直接、可靠的實驗證據。在本研究中，正是基于這些精確的動力學測量數據，才得以得出結論：提議的QL基序殘基的突變并未導致KM的顯著變化，從而證明這些殘基不構成QL位點。3. 實驗可靠性：使用這種專業的氧電極確保了數據的高質量和可重復性，為得出令人信服的結論奠定了堅實的技術基礎。