Location of the Substrate Binding Site of the Cytochrome bo3 Ubiquinol Oxidase from Escherichia coli

大腸桿菌細胞色素bo3泛醌氧化酶底物結合位點的定位

來源：Journal of the American Chemical Society, Volume 139, 2017, Pages 8346-8354

《美國化學會志》，第139卷，2017年，第8346-8354頁

 

摘要

這篇論文的摘要指出，細胞色素bo3是一種呼吸作用中泵浦質子的氧還原酶，它利用泛醌-8作為底物。當前公認的模型假設底物泛醌-8在一個低親和力位點被氧化，并將電子傳遞給一個在高親和力位點緊密結合的醌輔因子。然而，本研究的工作表明，結合在QH位點的Qs比之前認為的更具動態性。此外，對QH位點殘基的突變（這些突變并未完全消除酶活性）進行了重新檢驗，結果顯示它們具有底物結合位點突變所預期的特性：底物泛醌-1的KM值增加（高達4倍），以及抑制劑HQNO的表現Ki值增加（高達8倍）。這些數據表明，在cyt bo3中只存在一個泛醌結合位點，該位點對應于QH位點。

 

研究目的

本研究的主要目的是重新審視和確定細胞色素bo3泛醌氧化酶中底物（泛醌）結合位點的位置。具體來說，是挑戰長期以來認為該酶存在兩個獨立的醌結合位點（高親和力QH位點和低親和力QL位點）的“兩點模型”，并通過實驗證據論證底物氧化實際發生在傳統的QH位點，即支持“單一位點模型”。

 

研究思路

研究思路是通過對已知QH位點及其附近的特定殘基進行系統的定點誘變，并分析這些突變對酶功能的多方面影響。關鍵策略是選擇那些位于QH位點但突變后仍保留一定殘余酶活性的殘基（如D75和Q101）進行突變。然后，全面表征這些突變體，檢測其穩態酶動力學參數（kcat, KM）、對抑制劑（HQNO, aurachin C1-10）的敏感性、內源性泛醌-8的結合情況以及能否形成泛半醌自由基（通過EPR檢測）。此外，還設計了實驗來檢驗內源性Qs在去污劑和磷脂雙分子層環境下的交換動力學，以解釋以往支持兩點模型的觀察結果（如Qs難以被置換）可能是去污劑環境造成的人工假象。

 

測量的數據及研究意義

1.  穩態酶動力學數據（kcat和KM）：測量了野生型和一系列QH位點突變體（如D75E, Q101N, Q101A, Q101T, Q101L, Q101E, Q101M等）使用底物泛醌-1的氧化酶活性，并計算了它們的轉換數（kcat）和米氏常數（KM）。這些數據主要記錄在論文的Table 1中。研究意義：這些參數是評估酶催化效率和底物親和力的核心指標。如果QH位點就是底物結合位點，那么突變該位點的殘基預計會導致KM值（反映底物親和力）的顯著升高。實驗結果確實顯示，多個Q101的突變體（如Q101T, Q101L, Q101E）的KM值相比野生型大幅增加（最高達4倍），這強烈提示這些殘基直接參與底物結合。

 

2.  抑制劑敏感性數據（Kapp）：測量了野生型和突變體對抑制劑HQNO和aurachin C1-10的半數抑制濃度或表現Ki值（Kapp）。這些數據記錄在Table 1中。研究意義：如果抑制劑與底物競爭結合同一個位點，那么影響底物結合的突變也應同樣影響抑制劑的結合。實驗結果發現，多個QH位點突變（如D75E, Q101T, N157V）也導致了對HQNO和/或aurachin C1-10的Kapp值顯著增加（HQNO的Kapp最高增加約8倍，aurachin C1-10的最高增加約57倍），這表明抑制劑的結合位點與底物結合位點存在重疊，都涉及QH位點。

3.  內源性泛醌結合與半醌形成數據：通過HPLC分析了突變體純化后結合的泛醌-8含量，并通過EPR光譜檢測了在特定氧化還原條件下能否形成穩定的泛半醌信號。這些數據記錄在Table 1和Figure 2中。研究意義：這驗證了突變體仍然能夠結合Qs，并且大多數突變體（除Q101N等個別外）仍能形成半醌，但信號幅度和形狀有改變，表明突變確實影響了QH位點的微環境，而不是完全破壞了該位點。

 

4.  醌交換實驗數據：通過在磷脂質體（模擬膜環境）和去污劑膠束（DDM）中進行的醌置換實驗，分析了內源性Qs被外源性醌（如Q2, Q4, Q10）置換的效率。這些定量數據記錄在Table 2中。研究意義：該實驗旨在解釋以往支持兩點模型的關鍵證據（即DDM中結合的Qs難以被置換）。結果表明，在磷脂雙分子層中，Qs可以相對較快地（數小時尺度）從酶上解離和交換；即使在DDM中，使用具有適當長度異戊二烯側鏈的醌（如Q2, Q4）也能有效置換內源性Qs。這說明Qs在DDM中的“緊密結合”可能是一種由于醌在膠束間交換緩慢以及Qs在DDM中溶解度低而造成的假象，并不能證明在生理膜環境中也存在同樣緩慢的交換。

 

 

結論

本研究得出的主要結論是：實驗數據強烈支持細胞色素bo3中只存在一個主要的醌結合位點，該位點既是穩定泛半醌中間體的高親和力位點（QH位點），也是底物泛醌發生氧化的位點（即傳統的QL位點與QH位點是重合的）。1. 對QH位點殘基的突變能同時影響底物親和力（KM增加）和抑制劑結合（Kapp增加），這符合單一位點模型的預期。2. 以往支持兩點模型的觀察結果，特別是內源性Qs在去污劑環境中難以交換的現象，可以通過醌在去污劑膠束中的特殊物理化學行為（如溶解度低、膠束間交換慢）以及醌分子通過其異戊二烯側鏈與蛋白質的額外相互作用來解釋。在更接近生理狀態的磷脂雙分子層中，Qs的交換行為更具動態性。因此，需要對細胞色素bo3的催化模型進行修正，轉向單一位點模型。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

在本文中，使用丹麥Unisense氧微呼吸傳感器測量穩態泛醌-1氧化酶活性具有關鍵的研究意義。該電極用于實時、高靈敏度地監測反應體系中溶解氧的消耗速率。其研究意義在于：1. 獲取可靠動力學參數的基礎：通過精確測量初始耗氧速率隨底物Q1H2濃度變化的曲線，可以計算出準確的酶催化轉換數（kcat）和米氏常數（KM）。這些參數是定量比較野生型與各種QH位點突變體功能差異的黃金標準，是本研究得出“KM值顯著增加”這一關鍵證據的技術前提。2. 高精度與可靠性：Unisense傳感器提供了高精度的氧濃度測量，確保了所得動力學數據的高質量和可重復性，這對于檢測那些活性部分保留的突變體所表現的細微但重要的變化至關重要。3. 功能驗證的直接手段：通過這種直接測量活性的方法，證實了即使是對QH位點進行突變，酶仍能催化底物氧化，只是效率改變，從而允許研究人員進一步分析這些突變對KM和抑制劑敏感性的特異性影響，而不是僅僅因為活性完全喪失而無法分析。總之，該技術的應用為本研究提供了堅實、定量的功能數據，是連接定點誘變（結構改變）與酶功能變化（動力學參數改變）的橋梁，從而為論證單一位點模型提供了核心的實驗證據。