Therapeutic effect of molecular hydrogen in corneal UVB-induced oxidative stress and corneal photodamage

分子氫對UVB誘導(dǎo)的角膜氧化應(yīng)激和光損傷的治療作用

來源：Scientific Reports, Volume 7, Article number: 18017, 2017

《科學(xué)報告》，第7卷，文章編號：18017，2017年

 

摘要

本研究旨在檢驗分子氫是否能夠減輕UVB輻射誘導(dǎo)的角膜損傷后的氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，UVB輻射會導(dǎo)致角膜上皮中抗氧化酶和促氧化酶之間的失衡，以及金屬蛋白酶與其生理抑制劑之間的失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和角膜內(nèi)炎癥的發(fā)展。在UVB照射和愈合期間，使用溶解于PBS中濃度為0.5 ppm wt/vol的H2處理兔角膜。未經(jīng)處理或僅用緩沖液處理的照射角膜出現(xiàn)了氧化應(yīng)激、過度炎癥、丙二醛和硝基酪氨酸表達，愈合并伴有瘢痕形成和新生血管。相比之下，經(jīng)H2處理的照射角膜，氧化應(yīng)激被抑制，丙二醛和硝基酪氨酸表達缺失，角膜愈合并恢復(fù)了透明度。該研究首次提供了H2在預(yù)防UVB照射角膜氧化和亞硝化應(yīng)激中作用的證據(jù)。

 

研究目的

本研究的主要目的是檢驗分子氫是否能減輕由UVB輻射引起的角膜氧化應(yīng)激損傷。具體來說，是研究局部應(yīng)用H2溶液是否能防止或減少UVB誘導(dǎo)的角膜抗氧化/促氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、新生血管形成以及角膜混濁，從而促進角膜的透明愈合。

 

研究思路

研究思路是通過建立兔角膜UVB損傷模型（每日劑量1.0 J/cm2，連續(xù)四天），并設(shè)置不同的處理組進行比較。一組在UVB照射期間和照射后使用H2溶液滴眼；另一組使用不含H2的PBS緩沖液滴眼作為對照；還有一組照射后不作任何處理。通過免疫組織化學(xué)、實時熒光定量PCR、角膜厚度測量（作為水合作用的指標）等方法，系統(tǒng)比較各組在角膜酶平衡、細胞角蛋白表達、炎癥因子、氧化應(yīng)激標志物、細胞凋亡、新生血管、角膜透明度恢復(fù)等方面的差異，從而評估H2的治療效果。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1.  角膜上皮酶平衡相關(guān)數(shù)據(jù)：檢測了抗氧化酶（SOD, GPX, CAT）和促氧化酶（XOX, DAAO）以及金屬蛋白酶（MMP2, MMP9）及其抑制劑（TIMP2, TIMP4）的表達。這些數(shù)據(jù)主要通過免疫組化和實時定量PCR獲得，主要展示在Figure 1及其補充數(shù)據(jù)中。研究意義：這些數(shù)據(jù)直接驗證了H2是否能維持UVB照射后角膜上皮的抗氧化/促氧化平衡和蛋白酶/抗蛋白酶平衡，這是抑制氧化應(yīng)激和炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

 

2.  角膜上皮細胞角蛋白表達數(shù)據(jù)：通過實時定量PCR和免疫組化檢測了角蛋白K3和K12的表達。這些數(shù)據(jù)展示在Figure 1A, B, C中。研究意義：K3和K12是角膜上皮分化和健康的標志。H2處理組K3/K12高表達表明H2促進了角膜上皮的修復(fù)和正常分化，有利于透明愈合。

3.  炎癥與氧化應(yīng)激標志物數(shù)據(jù)：檢測了炎癥因子IL-1β, TGF-β以及氧化應(yīng)激標志物MDA, NT的表達。這些數(shù)據(jù)通過免疫組化和實時定量PCR獲得，展示在Figure 2中。研究意義：這些數(shù)據(jù)表明H2具有抗炎和抗氧化作用，能有效抑制UVB誘導(dǎo)的角膜炎癥反應(yīng)和氧化/硝化損傷。

 

4.  細胞凋亡與新生血管相關(guān)數(shù)據(jù)：通過檢測活化的caspase-3評估細胞凋亡，通過檢測VEGF表達和直接觀察評估新生血管。這些數(shù)據(jù)展示在Figure 3和Figure 4中。研究意義：結(jié)果表明H2能減少UVB誘導(dǎo)的角膜細胞凋亡，并通過下調(diào)VEGF表達抑制角膜新生血管形成，這對于避免角膜瘢痕化和保持透明度至關(guān)重要。

 

 

5.  角膜厚度數(shù)據(jù)：使用超聲角膜測厚儀測量中央角膜厚度，作為評估角膜水合程度和透明度的指標。這些數(shù)據(jù)展示在Figure 5中。研究意義：角膜厚度增加（水腫）會導(dǎo)致光散射和混濁。H2處理能顯著減輕UVB引起的角膜水腫并促進其恢復(fù)，直接證明了H2在維持和恢復(fù)角膜透明度方面的積極作用。

 

 

結(jié)論

本研究得出的主要結(jié)論是：局部應(yīng)用分子氫（H2）溶液能有效預(yù)防和治療兔角膜UVB光損傷。1. H2能維持UVB照射后角膜上皮的抗氧化/促氧化和蛋白酶/抗蛋白酶平衡，從而抑制氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激。2. H2展現(xiàn)出抗炎、抗凋亡和抗血管生成的多重有益作用，表現(xiàn)為降低炎癥因子（IL-1β, TGF-β）、減少細胞凋亡、抑制VEGF表達和新生血管。3. H2能顯著減輕角膜水腫，促進角膜厚度恢復(fù)正常，最終實現(xiàn)角膜的透明愈合，避免瘢痕形成。因此，分子氫是一種有效的、無毒的抗氧化劑，有望用于預(yù)防和治療角膜光損傷。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

在本文中，使用丹麥Unisense H2微傳感器測量PBS中溶解的分子氫濃度具有重要的研究意義。該傳感器是克拉克型的，通過測量氫分壓，其信號電流在pA范圍，可通過儀表轉(zhuǎn)換為溶解分子氫的濃度（mmol/L）。研究意義在于：1. 準確量化H2干預(yù)濃度：作為對主要測量方法（Trustlex ENH-1000設(shè)備）的對照驗證，Unisense傳感器提供了另一種精確的濃度測量手段，確保實驗中使用的H2溶液濃度（約0.5-0.57 ppm）是準確和一致的。這是保證實驗結(jié)果可靠性和可重復(fù)性的重要前提。2. 確保實驗處理的有效性：通過精確測定H2濃度，研究人員能夠確認每次滴眼使用的H2溶液確實含有有效劑量的活性成分，從而將觀察到的治療效果（如抗氧化、抗炎）與特定濃度的H2干預(yù)明確關(guān)聯(lián)起來。3. 技術(shù)互補性與可靠性：使用兩種不同的方法（Trustlex和Unisense）測量H2濃度，且結(jié)果差異在15%以內(nèi)，增強了數(shù)據(jù)測量的可信度，表明所制備的H2溶液濃度是穩(wěn)定和可信的。總之，丹麥Unisense電極的應(yīng)用為本研究提供了關(guān)鍵的H2濃度定量保障，確保了實驗處理的標準化和結(jié)果解讀的準確性，是連接H2干預(yù)與 observed biological effects之間的重要技術(shù)橋梁。