Concentration-dependent metabolic effects of metformin in healthy and Fanconi anemia lymphoblast cells

二甲雙胍在健康和范可尼貧血淋巴母細(xì)胞中的濃度依賴(lài)性代謝效應(yīng)

來(lái)源：Journal of Cellular Physiology, Volume 233, 2017, Pages 1736-1751

《細(xì)胞生理學(xué)雜志》，第233卷，2017年，第1736-1751頁(yè)

 

摘要

這篇論文摘要討論了二甲雙胍（MET）作為一種常用糖尿病藥物，在體外研究中常使用高濃度（10-100倍于患者血漿濃度）的問(wèn)題。研究評(píng)估了不同濃度MET對(duì)細(xì)胞生化、代謝和形態(tài)的影響，并測(cè)試了MET對(duì)范可尼貧血（FA）細(xì)胞和人類(lèi)早幼粒白血病（HL60）細(xì)胞系的作用。發(fā)現(xiàn)野生型細(xì)胞對(duì)MET的反應(yīng)呈濃度依賴(lài)性：低濃度（15和150μM）通過(guò)AMPK/Sirt1通路增加氧化磷酸化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，而高濃度（1.5 mM）抑制呼吸鏈、改變細(xì)胞形態(tài)并產(chǎn)生毒性。在FA細(xì)胞中，MET無(wú)法糾正能量/呼吸缺陷，也不改善氧化應(yīng)激和DNA損傷反應(yīng)。相反，HL60細(xì)胞在150μM時(shí)即表現(xiàn)出敏感性。結(jié)果強(qiáng)調(diào)MET濃度在評(píng)估細(xì)胞代謝效應(yīng)中的重要性，并表明使用高濃度MET的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能直接用于理解臨床效應(yīng)。

 

研究目的

本研究旨在闡明二甲雙胍（MET）濃度依賴(lài)性效應(yīng)對(duì)細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激和生化反應(yīng)通路的影響，使用三個(gè)MET濃度（15μM、150μM和1.5 mM），分別對(duì)應(yīng)患者血漿濃度、中間濃度和抑制復(fù)合物I的濃度。同時(shí)，評(píng)估MET對(duì)范可尼貧血（FA）細(xì)胞（一種存在能量和葡萄糖代謝缺陷的DNA修復(fù)遺傳病）和HL60白血病細(xì)胞的作用，以探討MET作為潛在治療候選物的可行性。

 

研究思路

研究思路包括使用野生型、FA和FA校正的淋巴母細(xì)胞系以及HL60細(xì)胞系，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用不同濃度MET處理24小時(shí)后，通過(guò)多種技術(shù)評(píng)估效應(yīng)：細(xì)胞存活和形態(tài)使用流式細(xì)胞術(shù)和電子顯微鏡；能量代謝通過(guò)測(cè)量ATP/AMP比、葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生、氧消耗（使用丹麥Unisense電極）、復(fù)合物活性和線(xiàn)粒體質(zhì)量等；氧化應(yīng)激通過(guò)ROS、MDA、GSH和過(guò)氧化氫酶活性檢測(cè)；信號(hào)通路通過(guò)Western blot分析AMPK磷酸化和Sirt1表達(dá)；DNA損傷通過(guò)彗星試驗(yàn)和染色體斷裂試驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，比較濃度差異和細(xì)胞類(lèi)型差異。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 細(xì)胞存活和形態(tài)數(shù)據(jù)：MET在1.5 mM時(shí)導(dǎo)致野生型細(xì)胞死亡約40%，并引起線(xiàn)粒體腫脹和結(jié)構(gòu)改變（圖1a、1b）。研究意義在于證實(shí)高濃度MET的細(xì)胞毒性，強(qiáng)調(diào)濃度選擇在體外實(shí)驗(yàn)中的臨界性，避免誤導(dǎo)性結(jié)論。

 

2 能量代謝數(shù)據(jù)：低濃度MET增加ATP含量和ATP/AMP比（圖2a），增強(qiáng)PDH活性（圖3a）、復(fù)合物I活性（圖3b）、氧消耗（圖3c）和ATP合成（圖3d），但不影響葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生（圖2b、2c）；高濃度MET抑制有氧代謝，增加糖酵解（圖2b、2c）。研究意義在于揭示MET濃度依賴(lài)性雙向調(diào)節(jié)有氧代謝，低濃度促進(jìn)線(xiàn)粒體功能，高濃度誘導(dǎo)糖酵解轉(zhuǎn)換，為MET的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供實(shí)證。

 

 

3 氧化應(yīng)激數(shù)據(jù)：低濃度MET增加ROS產(chǎn)生（圖4a）和MDA水平（圖4b），但同時(shí)增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活性（圖4d）和GSH水平（圖4e）；高濃度MET降低氧化應(yīng)激但不增強(qiáng)抗氧化防御。研究意義在于表明MET誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與線(xiàn)粒體活性相關(guān)，低濃度觸發(fā)適應(yīng)性抗氧化反應(yīng)，而高濃度直接抑制電子傳遞鏈，影響氧化還原平衡。

 

4 信號(hào)通路數(shù)據(jù)：低濃度MET激活A(yù)MPK磷酸化和增加Sirt1表達(dá)（圖5），高濃度僅增加Sirt1表達(dá)。研究意義在于確認(rèn)MET通過(guò)AMPK/Sirt1通路調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體生物合成，解釋其濃度依賴(lài)性代謝效應(yīng)。

 

5 DNA穩(wěn)定性數(shù)據(jù)：彗星試驗(yàn)顯示MET處理未增加DNA鏈斷裂（表1），染色體斷裂試驗(yàn)在FA細(xì)胞中無(wú)改善（表3）。研究意義在于表明MET在測(cè)試濃度下不引起DNA損傷，但在FA細(xì)胞中無(wú)法糾正固有DNA修復(fù)缺陷，提示其治療局限性。

 

 

6 FA細(xì)胞特異性數(shù)據(jù)：MET在FA細(xì)胞中雖增加線(xiàn)粒體質(zhì)量（圖6c），但氧消耗和ATP合成改善有限（圖6e、6f），且不增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)（圖7）。研究意義在于揭示FA細(xì)胞線(xiàn)粒體缺陷（復(fù)合物I-III異常）削弱MET效益，強(qiáng)調(diào)疾病背景對(duì)藥物反應(yīng)的影響。

 

 

 

結(jié)論

1 二甲雙胍效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性：低濃度（15和150μM）增強(qiáng)有氧代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)AMPK/Sirt1通路；高濃度（1.5 mM）抑制呼吸鏈，促進(jìn)糖酵解，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。

2 在范可尼貧血細(xì)胞中，MET無(wú)法有效糾正能量代謝缺陷、氧化應(yīng)激或DNA損傷反應(yīng)，因FA細(xì)胞存在固有線(xiàn)粒體電子傳遞障礙，限制MET作用。

3 研究強(qiáng)調(diào)體外使用高濃度MET的數(shù)據(jù)不能直接外推至臨床，實(shí)際患者血漿濃度（低濃度）更可能通過(guò)增強(qiáng)有氧代謝發(fā)揮效益，而非抑制效應(yīng)。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense電極測(cè)量的氧消耗數(shù)據(jù)具有關(guān)鍵研究意義，因?yàn)樗峁┝藢?shí)時(shí)、高精度的線(xiàn)粒體呼吸功能定量評(píng)估。Unisense電極基于安培法原理，通過(guò)檢測(cè)封閉腔室中氧分壓變化計(jì)算氧消耗率，直接反映細(xì)胞有氧代謝活性。在本研究中，電極數(shù)據(jù)（如圖3c）顯示低濃度MET增加氧消耗，表明增強(qiáng)氧化磷酸化；而高濃度MET抑制氧消耗，證實(shí)呼吸鏈抑制。研究意義包括：首先，電極測(cè)量提供了客觀(guān)的線(xiàn)粒體功能指標(biāo)，驗(yàn)證MET濃度依賴(lài)性效應(yīng)，區(qū)分促有氧和抑制性作用。其次，通過(guò)添加底物（如丙酮酸/蘋(píng)果酸或琥珀酸）和抑制劑（如魚(yú)藤酮），電極數(shù)據(jù)可特異性評(píng)估電子傳遞鏈不同通路（復(fù)合物I-III-IV vs II-III-IV），揭示MET主要影響復(fù)合物I途徑。此外，在FA細(xì)胞中，電極顯示氧消耗改善有限，突顯線(xiàn)粒體缺陷對(duì)藥物反應(yīng)的干擾。總體而言，Unisense電極的應(yīng)用增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的可靠性，為MET代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供了直接生理學(xué)證據(jù)，支持濃度依賴(lài)性結(jié)論的嚴(yán)謹(jǐn)性。