Characterization of Biological Secretions Binding to Graphene Oxide in Water and the Specific Toxicological Mechanisms

水中與氧化石墨烯結(jié)合的生物分泌物的特性和特定的毒理學機制

來源：Environ. Sci. Technol. 2016, 50, 8530?8537

 

論文摘要總結(jié)

本研究探討了石墨烯氧化物納米片（GONS）在水環(huán)境中與生物分泌物（如蛋白質(zhì)、多糖、小分子有機物和核苷酸）結(jié)合后形成的復(fù)合物（GOBS）的特性及其毒性機制。通過斑馬魚胚胎模型，研究發(fā)現(xiàn)分泌物能主動結(jié)合到GONS表面，形成厚度約10 nm、橫向尺寸19.5–282 nm的納米片結(jié)構(gòu)。與原始GONS相比，GOBS具有更小的尺寸、更高負電性和更低聚集性，但毒性顯著增強，導(dǎo)致胚胎死亡率、畸形率、β-半乳糖苷酶上調(diào)和線粒體膜電位損失升高。毒性機制主要歸因于GOBS在胚胎表面形成涂層，抑制氧氣和離子交換，而非活性氧（ROS）途徑。研究強調(diào)，在納米毒理學中需關(guān)注自然涂層對納米材料行為的影響。

研究目的

本研究旨在解決以下關(guān)鍵問題：

 

評估分泌物對GONS行為的影響：探究水生生物分泌物如何改變GONS的物理化學性質(zhì)（如形貌、聚集狀態(tài)）和毒性。

揭示毒性增強機制：比較GONS和GOBS的毒性差異，明確其分子和細胞水平的作用路徑（如氧化應(yīng)激、基因損傷、物質(zhì)交換抑制）。

 

提供環(huán)境風險依據(jù)：為GONS在水環(huán)境中的實際風險評估提供數(shù)據(jù)支持，考慮自然因素（如分泌物）的調(diào)控作用。

 

研究思路

研究分為四個階段：

 

GOBS制備與表征：將GONS與斑馬魚培養(yǎng)液中的分泌物混合，通過離心和冷凍干燥獲得GOBS；使用熱重分析（TGA）、X射線光電子能譜（XPS）、SDS-PAGE等技術(shù)分析結(jié)合成分（如蛋白質(zhì)、多糖、DNA）。

毒性效應(yīng)評估：暴露斑馬魚胚胎至GONS和GOBS（0.01–1 mg/L），檢測死亡率、畸形率、心跳變化及β-半乳糖苷酶活性（衰老標志）。

機制探究：通過拉曼光譜驗證胚胎表面涂層；使用Unisense電極測量氧濃度梯度，并檢測Ca2?交換，分析物質(zhì)交換抑制機制。

 

數(shù)據(jù)整合與驗證：結(jié)合形貌（AFM/TEM）、聚集狀態(tài)（DLS）和電化學數(shù)據(jù)，建立性質(zhì)-毒性關(guān)聯(lián)，并通過統(tǒng)計學分析確認顯著性。

 

測量數(shù)據(jù)及研究意義

以下關(guān)鍵數(shù)據(jù)均來自論文中的圖表，其研究意義如下：

 

分泌物結(jié)合表征（Figure 1）

 

數(shù)據(jù)來源：Figure 1a TGA顯示GOBS熱解階段增多，表明成分復(fù)雜；Figure 1b-c XPS證實GOBS含N、P元素（來自蛋白質(zhì)/核苷酸）；Figure 1d SDS-PAGE顯示GOBS攜帶分泌物蛋白。

 

研究意義：分泌物通過氫鍵和π-π堆疊與GONS結(jié)合，形成有機-無機復(fù)合物，改變表面化學性質(zhì)，為毒性增強提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

 

毒性生物標志物（Figure 2）

 

數(shù)據(jù)來源：Figure 2a-b顯示ROS無顯著變化，但GOBS淬滅未配對電子能力更強（EPR信號降27.3%）；Figure 2c-f顯示GOBS組DNA甲基化（7.8%）、8-OHdG（34.1%）、β-半乳糖苷酶活性和線粒體膜電位損失均高于GONS。

 

研究意義：毒性不依賴ROS途徑，而與基因損傷和細胞衰老相關(guān)；β-半乳糖苷酶可作為替代ROS的毒性指標。

 

涂層與物質(zhì)交換抑制（Figure 3）

 

數(shù)據(jù)來源：Figure 3a拉曼光譜證實GOBS在胚胎表面吸附更強；Figure 3b使用Unisense電極顯示GOBS組胚胎內(nèi)氧濃度降低10%（深度0-250 μm）；Figure 3c顯示Ca2?交換抑制31%。

 

研究意義：GOBS涂層物理阻隔氧氣和離子交換，是毒性主要機制；Unisense數(shù)據(jù)直接驗證局部缺氧假設(shè)。

 

形貌與聚集狀態(tài)（附圖S6-S9）

 

數(shù)據(jù)來源：AFM/TEM顯示GOBS為納米片（厚度10 nm），GONS為單層（0.83 nm）；DLS和Zeta電位表明GOBS分散性更好（負電荷增強）。

 

研究意義：小尺寸和高分散性使GOBS更易覆蓋胚胎表面，解釋其毒性更強。

 

結(jié)論

本研究主要結(jié)論如下：

 

分泌物改變GONS性質(zhì)：形成更小、更穩(wěn)定的GOBS復(fù)合物，增強生物相容性但意外提高毒性。

毒性機制以涂層作用為主：GOBS通過物理覆蓋抑制胚胎氧氣/離子交換，導(dǎo)致缺氧和代謝紊亂，而非氧化應(yīng)激。

環(huán)境啟示：自然分泌物可能放大納米材料風險，評價體系需包含“獲得性涂層”效應(yīng)；β-半乳糖苷酶是潛在毒性標志物。

 

應(yīng)用警示：GONS在真實水環(huán)境中的毒性可能被低估，需考慮生物分泌物的調(diào)制作用。

 

丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的詳細解讀

在研究中，丹麥Unisense CAL300氧微傳感器被用于定量測量斑馬魚胚胎內(nèi)的局部氧濃度（實驗部分和Figure 3b），其研究意義如下：

 

高空間分辨率驗證涂層機制：Unisense電極的微米級尖端（校準后）允許在胚胎絨毛膜與胚胎物質(zhì)間的微環(huán)境（深度0-250 μm，間隔50 μm）直接測量氧分壓。數(shù)據(jù)顯示，GOBS暴露組氧濃度降低10%（Figure 3b），而GONS組降低8.9%，對照組變化<2%。這種原位測量避免了整體溶液稀釋效應(yīng)，精準捕捉到涂層導(dǎo)致的局部缺氧，直接支持“物理屏蔽”機制。

排除間接干擾：通過校準（氮氣0%、空氣20.8%飽和）和深度剖面測量，Unisense數(shù)據(jù)排除了體相氧濃度變化的干擾，證實缺氧源于胚胎表面涂層而非溶液缺氧。這與ROS未升高（Figure 2a）結(jié)論一致，強化了毒性非氧化應(yīng)激特性。

技術(shù)優(yōu)勢與創(chuàng)新性：相比傳統(tǒng)Clark電極，Unisense傳感器體積小、響應(yīng)快，適用于微區(qū)測量（如胚胎間隙），解決了低通量體系檢測難題。本研究將其與Ca2?交換數(shù)據(jù)（Figure 3c）結(jié)合，揭示涂層對多重物質(zhì)交換的抑制，凸顯其在機制研究中的多維應(yīng)用價值。

 

環(huán)境毒理學意義：Unisense數(shù)據(jù)證明，即使低濃度GOBS（1 mg/L）也能引起顯著氧交換障礙，警示真實環(huán)境中納米材料可能通過類似涂層效應(yīng)影響水生生物呼吸。該結(jié)果為生態(tài)風險評價提供了微觀生理學證據(jù)。

 

總之，Unisense電極不僅是檢測工具，更是連接納米材料性質(zhì)與生理響應(yīng)的關(guān)鍵橋梁，其數(shù)據(jù)可靠性為涂層機制提供了不可替代的實證支持。