Optimized Real-Time Monitoring of Glutathione Redox Status in Single Pyramidal Neurons in Organotypic Hippocampal Slices during Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion

優(yōu)化實時監(jiān)測器官型海馬切片中單個錐體神經(jīng)元在氧糖剝奪和再灌注期間的谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)

來源：ACS Chemical Neuroscience, 6, 2015, 1838?1848

《ACS化學(xué)神經(jīng)科學(xué)》，第6卷，2015年，第1838?1848頁

 

摘要：

摘要描述了研究通過轉(zhuǎn)染Grx1-roGFP2融合蛋白到器官型海馬切片培養(yǎng)（OHSCs）的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元中，實時監(jiān)測氧糖剝奪和再灌注（OGD/RP）過程中谷胱甘肽（GSH）系統(tǒng)的變化。研究優(yōu)化了灌注系統(tǒng)，確保pO2變化與體內(nèi)中風(fēng)模型時間尺度一致，并使用tdTomato作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)改進校準(zhǔn)。結(jié)果顯示，在線粒體中，GSH系統(tǒng)在OGD期間變得更還原，在RP期間更氧化，而細(xì)胞質(zhì)中沒有顯著變化。

 

研究目的：

研究目的是開發(fā)一種優(yōu)化方法來實時監(jiān)測腦卒中體外模型（OGD/RP）中GSH氧化還原狀態(tài)的變化，特別是在單神經(jīng)元水平，以理解氧化應(yīng)激在神經(jīng)元損傷中的作用。

 

研究思路：

研究思路包括：首先，通過基因槍或單細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染cyto-或mito-Grx1-roGFP2到OHSCs的錐體神經(jīng)元中， targeting cells in a narrow depth range；其次，優(yōu)化灌注系統(tǒng)（如[O+V]系統(tǒng)）以實現(xiàn)快速、可重復(fù)的溶液交換，模擬體內(nèi)pO2變化；然后，使用丹麥Unisense電極測量pO2隨深度和時間的變化；最后，利用tdTomato校準(zhǔn)Grx1-roGFP2信號，定量分析氧化還原參數(shù)（如OxDroGFP2和E_GSH），并應(yīng)用于OGD/RP協(xié)議。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義：

1. 測量了pO2在不同灌注系統(tǒng)中的變化（圖1），研究意義是驗證了優(yōu)化系統(tǒng)[O+V]能快速控制pO2，確保實驗條件與體內(nèi)中風(fēng)模型可比，提高了模擬的可靠性。

 

2. 測量了pO2隨OHSC深度的變化（圖2），研究意義是確定了轉(zhuǎn)染細(xì)胞所在深度范圍（30-45μm）的pO2可控且一致，為單神經(jīng)元測量提供了可重復(fù)的環(huán)境。

 

3. 測量了mito-Grx1-roGFP2信號與pO2變化的同步性（圖3），研究意義是證實了傳感器能快速響應(yīng)OGD/RP過程中的氧化還原變化，驗證了方法的實時性。

 

4. 測量了tdTomato作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)Grx1-roGFP2的效果（圖4），研究意義是解決了OGD/RP后細(xì)胞形態(tài)變化對熒光信號的干擾，使氧化還原參數(shù)（如OxDroGFP2）的定量更準(zhǔn)確。

 

5. 測量了線粒體和細(xì)胞質(zhì)中GSH氧化還原狀態(tài)在OGD/RP過程中的變化（圖5），研究意義是揭示了線粒體GSH系統(tǒng)在OGD期間更還原、RP期間更氧化的動態(tài)變化，而細(xì)胞質(zhì)無顯著變化，表明線粒體對氧化應(yīng)激更敏感，為理解腦卒中機制提供了新見解。

 

 

結(jié)論：

結(jié)論是線粒體GSH系統(tǒng)在OGD期間變得更還原（OxDroGFP2從0.30降至0.10），在RP期間變得更氧化（OxDroGFP2升至0.45），而細(xì)胞質(zhì)中沒有顯著變化。這表明線粒體對氧化應(yīng)激響應(yīng)更敏感，可能由還原當(dāng)量供應(yīng)變化主導(dǎo)，而非ROS增加。該方法可用于藥理研究等擴展應(yīng)用。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義：

使用丹麥Unisense電極測量pO2數(shù)據(jù)的研究意義在于，它優(yōu)化了實驗的可靠性和可比性。通過測量pO2隨深度和時間的變化，研究驗證了優(yōu)化灌注系統(tǒng)[O+V]能實現(xiàn)快速溶液交換（τ小于30秒），使pO2變化時間尺度（約2分鐘）與體內(nèi)中風(fēng)模型（如腦血流和pO2變化）一致。這確保了OGD/RP實驗條件更接近生理情況，提高了對GSH氧化還原狀態(tài)監(jiān)測的準(zhǔn)確性，為理解腦卒中中氧化應(yīng)激機制提供了可靠工具。