Optimized Real-Time Monitoring of Glutathione Redox Status in Single Pyramidal Neurons in Organotypic Hippocampal Slices during Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion

優(yōu)化實時監(jiān)測器官型海馬切片中單個錐體神經(jīng)元在氧糖剝奪和再灌注期間的谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)

來源：ACS Chemical Neuroscience, 2015, 6, 11, 1838–1848

《ACS化學(xué)神經(jīng)科學(xué)》，2015年，第6卷第11期，第1838–1848頁

 

摘要

本研究通過將氧化還原敏感的Grx1-roGFP2融合蛋白轉(zhuǎn)染到器官型海馬切片培養(yǎng)物（OHSCs）CA1區(qū)的單個錐體神經(jīng)元中，優(yōu)化了實時監(jiān)測谷胱甘肽（GSH）系統(tǒng)在氧糖剝奪和再灌注（OGD/RP）期間的變化。開發(fā)了優(yōu)化的灌注系統(tǒng)，確保組織內(nèi)pO2快速可控變化，模擬急性中風(fēng)條件。使用共轉(zhuǎn)染的tdTomato作為內(nèi)標，提高Grx1-roGFP2氧化還原狀態(tài)定量測量的準確性。結(jié)果表明，在OGD期間，線粒體中GSH還原電位（EGSH）變得更還原，而在RP期間變得更氧化，而細胞質(zhì)中的變化不顯著。

 

研究目的

本研究旨在開發(fā)一種優(yōu)化方法，用于實時監(jiān)測OHSCs中單個錐體神經(jīng)元在OGD/RP期間的GSH氧化還原狀態(tài)，以模擬中風(fēng)等缺血性損傷的體外模型。通過改進灌注系統(tǒng)和傳感器校準，提高測量的時空分辨率，區(qū)分線粒體和細胞質(zhì)中的氧化還原動態(tài)。

 

研究思路

研究采用器官型海馬切片培養(yǎng)物（OHSCs）作為模型，通過基因槍或單細胞電穿孔將Grx1-roGFP2傳感器轉(zhuǎn)染到CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的細胞質(zhì)或線粒體中。優(yōu)化灌注系統(tǒng)（如[O+V]系統(tǒng)），使用在線氧合器和真空抽吸，實現(xiàn)快速溶液交換和控制pO2。使用丹麥Unisense氧微電極測量組織深度相關(guān)的pO2變化。在OGD/RP協(xié)議（10分鐘對照、20分鐘OGD、30分鐘RP）中，通過比率熒光成像監(jiān)測Grx1-roGFP2信號，并利用tdTomato作為內(nèi)標校準傳感器氧化度（OxDroGFP2）和EGSH。通過比較不同灌注系統(tǒng)和組織深度，驗證模型的體內(nèi)相關(guān)性。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1. pO2在灌注系統(tǒng)中的變化：數(shù)據(jù)來自Figure 1。測量顯示，優(yōu)化系統(tǒng)[O+V]能快速（τ<30秒）實現(xiàn)pO2穩(wěn)態(tài)變化，而傳統(tǒng)系統(tǒng)響應(yīng)慢。研究意義：確保OGD/RP期間pO2變化時間尺度與體內(nèi)中風(fēng)模型一致，提高實驗的生理相關(guān)性，為實時監(jiān)測氧化還原動態(tài)提供可靠環(huán)境。

 

2. pO2隨組織深度的分布：數(shù)據(jù)來自Figure 2。在OHSCs中，pO2從表面（約691 mmHg）到中間（最低358 mmHg）變化，轉(zhuǎn)染細胞位于30-45μm深度，該范圍內(nèi)pO2變化一致且快速（τ約2分鐘）。研究意義：證實轉(zhuǎn)染區(qū)域pO2可控，確保氧化還原測量在均勻缺氧條件下進行，減少深度異質(zhì)性帶來的偏差。

 

3. Grx1-roGFP2信號與pO2的同步變化：數(shù)據(jù)來自Figure 3。在OGD/RP期間，Grx1-roGFP2比率信號（R405/488）與pO2變化時間尺度一致，優(yōu)化系統(tǒng)[O+V]響應(yīng)最快。研究意義：驗證傳感器能實時反映氧化還原動態(tài)，且系統(tǒng)優(yōu)化確保信號變化與生理過程同步，為研究GSH系統(tǒng)在缺血中的角色提供直接證據(jù)。

 

4. tdTomato內(nèi)標校準細胞形態(tài)變化：數(shù)據(jù)來自Figure 4。OGD/RP后校準期間，細胞大小變化顯著，tdTomato信號作為內(nèi)標校正Grx1-roGFP2絕對強度，使OxDroGFP2計算穩(wěn)定。研究意義：解決應(yīng)激條件下細胞體積變化對熒光信號的干擾，提高氧化還原參數(shù)定量的準確性，確保EGSH推導(dǎo)可靠。

 

5. 線粒體和細胞質(zhì)GSH氧化還原變化：數(shù)據(jù)來自Figure 5。在線粒體中，OGD期間OxDroGFP2從0.30降至0.10（更還原），RP期間升至0.45（更氧化）；細胞質(zhì)中無顯著變化。EGSH在線粒體OGD期間更負（-351 mV），RP期間更正。研究意義：揭示線粒體GSH系統(tǒng)在缺血應(yīng)激中動態(tài)變化更敏感，提示還原等效物供應(yīng)（如NADPH）可能主導(dǎo)氧化還原狀態(tài)，而非ROS，為中風(fēng)機制提供新見解。

 

結(jié)論

優(yōu)化方法成功實現(xiàn)了OHSCs中單個錐體神經(jīng)元GSH氧化還原狀態(tài)的實時監(jiān)測。線粒體GSH系統(tǒng)在OGD期間迅速還原，RP期間氧化，而細胞質(zhì)系統(tǒng)保持穩(wěn)定，表明線粒體是缺血應(yīng)激的關(guān)鍵響應(yīng)區(qū)。該模型為研究中風(fēng)等疾病的氧化還原機制提供了高時空分辨率工具，并提示還原動力可能主導(dǎo)GSH狀態(tài)變化。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense氧微電極測量組織pO2具有關(guān)鍵研究意義。該電極具有高靈敏度（檢測限低至2 nM）和快速響應(yīng)時間（<2秒），能精確監(jiān)測OHSCs不同深度的氧氣梯度變化。通過測量pO2隨深度分布（Figure 2），驗證了轉(zhuǎn)染細胞區(qū)域（30-45μm）的pO2可控且變化時間尺度（τ約2分鐘）與體內(nèi)中風(fēng)模型一致，確保OGD/RP實驗的生理相關(guān)性。電極數(shù)據(jù)還用于優(yōu)化灌注系統(tǒng)（如Figure 1顯示[O+V]系統(tǒng)響應(yīng)最快），減少擴散延遲，使氧化還原傳感器信號能真實反映急性缺氧事件。此外，pO2與Grx1-roGFP2信號同步變化（Figure 3），證實了氧化還原動態(tài)與氧合狀態(tài)的直接關(guān)聯(lián)，為理解GSH系統(tǒng)在缺血中的調(diào)控提供了可靠環(huán)境參數(shù)。總之，Unisense電極的應(yīng)用增強了模型的整體可靠性，使體外研究更能模擬體內(nèi)條件。