Electron Acceptor-Dependent Respiratory and Physiological Stratifications in Biofilms

生物膜中電子受體相關的呼吸和生理學的分層研究

來源：Environ. Sci. Technol. 2015, 49, 196?202

 

1. 論文摘要內容

摘要指出，細菌呼吸是生物地球化學循環和生物修復過程中的關鍵驅動力。電子受體有可溶性和固態兩種形式，在環境中常常共存。理解附著在固態電子受體上的細菌如何應對環境中并存的可溶性替代電子受體至關重要。本研究使用微生物燃料電池作為工具，以Shewanella decolorationis和偶氮染料莧菜紅為模型。研究發現，浮游細胞和生物膜細胞表現出不同的呼吸模式：浮游細胞優先利用偶氮染料，而生物膜細胞能同時利用陽極和偶氮染料。這種額外的偶氮呼吸消耗了陽極生物膜內的質子積累。生物膜和陽極表面之間存在一個大的氧化還原電位差。改變陰極條件能立即影響陽極電位但不影響生物膜電位。當只利用陽極或偶氮染料作為唯一電子受體時，生物膜細胞活力呈現出相反且依賴于呼吸模式的分布；而當同時利用兩者時，細胞活力得到增強。這些結果為理解多電子受體環境中的細菌呼吸策略提供了新見解，并支持了Shewanella電極呼吸生物膜內存在“電子跳躍”機制。

2. 研究目的

本研究旨在探究當固態電子受體（微生物燃料電池的陽極）和可溶性替代電子受體（偶氮染料）共存時，它們如何影響陽極生物膜的呼吸活動、內部微環境（化學梯度）和生理狀態（細胞活力）。目的是于揭示細菌在多電子受體環境中的復雜呼吸策略和生物膜內的分層響應機制。

3. 研究思路

 

構建模型系統：構建雙室微生物燃料電池，接種Shewanella decolorationis S12菌株。以陽極作為固態電子受體，以不同濃度的偶氮染料莧菜紅作為可溶性替代電子受體。

性能與降解評估：比較有/無偶氮染料條件下，MFC的產電性能（電流）和偶氮染料的還原（降解）速率，評估兩者是競爭還是協同關系。

細胞生長分析：分別測量浮游細胞和陽極生物膜的生物量（以蛋白質含量計），明確不同位置的細胞對電子受體的偏好。

生物膜微環境原位測量：使用Unisense微電極系統，原位測量生物膜內部從溶液本體到電極表面的pH和氧化還原電位剖面，揭示化學梯度的形成與變化。

生物膜結構與生理分析：使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜的三維結構，并利用活/死染色分析生物膜從底部（近電極）到頂部（近溶液）不同層面的細胞活力分布。

 

機制關聯：將電化學性能、化學微環境數據與細胞生理狀態數據進行關聯，闡釋多電子受體條件下生物膜內呼吸與生理分層的機制。

 

4. 測量方面、數據來源及研究意義

 

電流生成與偶氮染料還原：測量了MFC的電流輸出（圖1B）和陽極液中偶氮染料濃度的變化（圖1A）。意義：直接證明在所選體系中，產電（陽極還原）和偶氮染料還原可以同時進行，且存在染料的MFC產生了更高的電流，表明存在協同而非簡單競爭。

 

浮游與生物膜細胞生長：通過蛋白質含量評估了浮游細胞（圖2A）和陽極生物膜（圖2B）的生物量。意義：揭示了空間分離的呼吸策略。數據顯示浮游細胞的生長主要由偶氮染料還原驅動，而生物膜的生長則同時受益于陽極呼吸和偶氮還原，表明生物膜細胞能利用兩種電子受體。

 

生物膜內pH剖面：使用pH微電極測量了從溶液本體到陽極表面的pH梯度（圖3A， B）。意義：直接證實了不同的呼吸模式導致生物膜內不同的質子動態。僅在陽極呼吸時，生物膜內出現pH下降梯度（質子積累）；而當同時進行偶氮呼吸時，該梯度減弱或消失，因為偶氮還原的副產物消耗了質子。

 

生物膜內氧化還原電位剖面：使用氧化還原微電極測量了電位梯度（圖3C， D）。意義：揭示了生物膜內部與電極表面之間的電子傳遞路徑。數據顯示，在所有生物膜內部，氧化還原電位均向電極表面持續下降約30 mV。更重要的是，生物膜內部的電位與陽極表面電位存在巨大差異，且生物膜電位不受陰極條件變化的即時影響，表明生物膜內部的氧化還原狀態相對獨立。

 

生物膜結構與活力分層：通過CLSM觀察了生物膜厚度和結構（圖4），并量化了生物膜不同深度層的細胞活力（圖4）。意義：將呼吸模式與細胞生理狀態在空間上直接關聯。數據顯示，僅以陽極呼吸時，生物膜底部（近電極）活力高，頂部活力低；僅以偶氮染料呼吸時，模式相反（頂部活力高）；而當同時利用兩者時，生物膜整體活力更高且分布更均勻。這直接證明了電子受體的可獲得性決定了生物膜內細胞的代謝活性分布。

 

 

5. 研究結論

 

空間分離的呼吸策略：在陽極室中，浮游細胞優先利用可溶性的偶氮染料，而生物膜細胞能夠同時利用陽極（固態）和偶氮染料（可溶性）進行呼吸。

生物膜內的化學與生理分層：生物膜內部的pH和氧化還原電位呈現化學分層，細胞活力呈現生理分層。這些分層模式嚴格依賴于可利用的電子受體類型。

協同效應與質子平衡：偶氮染料作為替代電子受體，不僅與陽極呼吸共存，還能消耗陽極呼吸產生的質子，緩解生物膜內的酸化和質子積累，這可能優化了產電過程。

獨立的生物膜微環境：生物膜內部的氧化還原電位自成體系，與電極表面電位存在顯著差距，且不受外部電極電位的即時調控，說明生物膜是一個具有自身氧化還原狀態的、相對獨立的代謝單元。

雙向電子傳遞提升活力：當生物膜能同時利用陽極和可溶性受體進行“雙向”電子傳遞時，其整體細胞活力和均勻性高于僅利用單一電子受體的生物膜，表明多電子受體通路可以補償部分細胞因電子傳遞路徑受限而導致的代謝低下。

 

支持“電子跳躍”機制：觀察到的生物膜內部氧化還原電位梯度和依賴于電子受體可及性的活力分層，與希瓦氏菌生物膜中通過可擴散電子媒介（如黃素）進行“電子跳躍”傳遞的機制相一致，這與Geobacter屬依賴菌毛進行“金屬樣”導電的機制不同。

 

6. 使用丹麥Unisense微電極測量數據的詳細解讀與研究意義

本文中使用丹麥Unisense公司的微電極（pH、氧化還原電位）所測得的數據具有關鍵的研究意義：

傳統測量方法通常只能獲取溶液本體（Bulk Solution）的平均化學值，而生物電化學反應的核心發生在電極-生物膜界面及生物膜內部這個微米尺度的空間里。溶液本體的參數無法反映反應位點的真實微環境。Unisense微電極的尖端極細（~25 μm），能夠原位、無損地穿刺進入生物膜內部，以高空間分辨率（通常為微米級步進）繪制從溶液本體到電極表面的化學參數剖面圖。這提供了以下不可替代的洞察：

 

直接證實質子動態與呼吸模式的關聯：pH剖面數據（圖3A， B）直接顯示，在僅以陽極呼吸的生物膜中，從生物膜-溶液界面到電極表面，pH值降低了約0.02個單位，形成了向內的下降梯度。這直接證實了陽極呼吸是一個釋氫過程，導致了生物膜內部的質子積累。相反，在同時進行陽極和偶氮呼吸的生物膜中，pH梯度減弱甚至消失。這是因為偶氮染料還原過程中產生的副產物（萘胺類物質）消耗了質子。微電極數據原位驗證了“額外電子受體可調節生物膜內pH”的假說，將宏觀的協同產電現象與微觀的質子平衡機制直接聯系起來。

揭示生物膜內部的氧化還原景觀與電子傳遞路徑：氧化還原電位剖面數據（圖3C， D）更為關鍵。數據顯示，在所有生物膜內部（無論利用何種電子受體），電位都隨著靠近電極表面而持續下降約30 mV。這形成了一個從生物膜外部到內部的還原性遞增的梯度。這一梯度是電子在生物膜內從細胞向最終電子受體（陽極或溶液中的染料）傳遞的物理體現。對于陽極呼吸生物膜，電位在逼近電極表面幾微米內急劇上升，這與基于電子媒介（黃素）的“電子跳躍”模型預測一致：還原態的媒介在生物膜內部將電子傳遞給氧化態媒介，最后在電極表面被氧化。

證明生物膜是一個電化學隔離的代謝單元：實驗中發現，改變陰極條件（如斷開電路或改變陰極液）能立即大幅改變陽極表面的電位，但對生物膜內部的氧化還原電位沒有即時影響。這一發現意義重大。它表明，雖然生物膜與電極緊密接觸并進行電子交換，但生物膜內部的氧化還原狀態是由其自身的微生物代謝和內部電子傳遞網絡所主導和緩沖的，而不是簡單地跟隨電極電位變化。這揭示了生物膜作為一個功能整體的相對獨立性和穩定性。

 

區分不同菌屬的電子傳遞機制：本研究觀察到的希瓦氏菌生物膜內部電位持續下降的剖面，與文獻中報道的Geobacter sulfurreducens生物膜內部電位相對均勻的剖面形成了鮮明對比。這種差異，結合微電極揭示的化學梯度，為區分兩種模式產電菌的電子傳遞機制（希瓦氏菌的“電子跳躍” vs. Geobacter的“金屬樣導電”）提供了關鍵的原位實驗證據。

 

總結：Unisense微電極提供的生物膜內原位pH和氧化還原電位剖面，是本研究的核心實驗突破。它將宏觀的系統行為（電流、染料降解）與微觀尺度的生物化學過程（質子代謝、電子傳遞梯度）在三維空間上精準地關聯起來。沒有這些高分辨率的原位測量，關于“質子積累與消耗”、“生物膜內獨立的氧化還原微環境”、“依賴于電子受體可及性的代謝分層”等關鍵機制將難以被直接證實和量化，使結論停留在推測層面。這些數據極大地增強了對多電子受體環境下生物膜呼吸生理學的理解深度。