材料與方法

小鼠、試劑和細(xì)胞系

C57BL/6雌性小鼠，6-8周齡，飼養(yǎng)溫度為25-29℃，濕度為50-76%，光/暗周期為12/12。所有涉及動物的實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國四川西南醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和治療委員會審查批準(zhǔn)。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照美國國立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南》。

實(shí)驗(yàn)中使用的LLC細(xì)胞系在PPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中保存。將約1×106個LLC細(xì)胞加入0.1毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，皮下注射到C57BL/6小鼠的右后腿近端。

人重組內(nèi)皮抑素Endostatin(rh-ES)儲存于4℃。然后將Endostar溶解在0.2毫升的0.9%生理鹽水(NS)中，以10毫克/千克/天的劑量對每只動物進(jìn)行腹腔注射(IP)。

吉西他濱根據(jù)之前的研究，將吉西他濱溶解在0.2毫升0.9%NS中，以每只動物30毫克/千克的劑量進(jìn)行腹腔注射。

治療組

圖1、治療方案。

LLC接種10天后，將腫瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、單用Endostar(ES)組、單用吉西他濱(GEM)組、先用Endostar組(ES/GEM)、先用吉西他濱組(GEM/ES)、Endostar和吉西他濱同時使用組(ES+GEM)(n=12，每組)[圖1]。簡言之，i)對照組(陰性對照)不作任何處理；ii)單用ES(10毫克/千克/天，14天)；iii)單用GEM(30毫克/千克/天，第1天和第8天給藥)；iv)ES/GEM(Endostar在第1-14天給藥，吉西他濱在第5天和第12天給藥)；v)GEM/ES(第2-15天服用Endostar，第1天和第8天服用吉西他濱)；vi)ES+GEM(第1-14天服用Endostar，第1天和第8天服用吉西他濱)。每兩天用卡尺測量一次腫瘤體積，腫瘤體積按以下公式計(jì)算：V=?ab2(其中V為腫瘤體積，a為主軸長度，b為次軸長度)。治療結(jié)束后，小鼠被處死。

流式細(xì)胞儀分析

解剖腫瘤組織并將其制成單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸浮液在70%的冷乙醇中固定12-24小時。然后，以1,000r/min的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，沉淀懸浮液。細(xì)胞在PBS(pH7.4)中沖洗2-3分鐘，然后以2,000r/min的轉(zhuǎn)速離心3-4分鐘。然后用碘化丙啶(PI)染色，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

免疫組織化學(xué)

用10%的中性甲醛固定腫瘤組織，用石蠟包埋并切成3μm的切片。然后，用蘇木精和伊紅(H&E)染料對切片進(jìn)行染色。隨后，用特異性抗體處理切片進(jìn)行分析。簡而言之，切片用兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子或α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗染色，然后用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的山羊抗鼠二抗孵育。然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)孵育切片并用蘇木精反染。

VEGF表達(dá)分析的計(jì)算方法如下：從每組6個腫瘤的切片中隨機(jī)選取5個區(qū)域。在400倍放大鏡下，將VEGF陽性細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)×100%。細(xì)胞質(zhì)呈中度或濃棕色染色為陽性，細(xì)胞質(zhì)未染色或呈淺棕色染色為陰性。

α-SMA表達(dá)分析的計(jì)算方法如下：從每組6個腫瘤的切片中隨機(jī)抽取5個區(qū)域。按照之前的描述，在200倍放大鏡下計(jì)算每平方毫米腫瘤樣本中α-SMA陽性圖譜的數(shù)量。

氧微電極

腫瘤組織中的氧分壓(PO2)由氧微電極(UnisenseA/S)測定。所有操作均按照制造商的說明進(jìn)行。簡而言之，在對微電極進(jìn)行極化和校準(zhǔn)后，將麻醉動物置于俯臥位。然后將微電極垂直插入腫瘤組織。計(jì)算腫瘤組織1/2、1/4、1/8和1/16短直徑處的PO2。然后使用數(shù)據(jù)采集軟件SenseTrace Pro(UnisenseA/S)記錄獲得的數(shù)據(jù)。為了觀察缺氧的變化，在第5、10和15天測量了每組5只動物的PO2。

顯微18F-FDG PET/CT成像

采用Inveon micro PET/CT動物掃描儀測量各組小鼠的早期腫瘤反應(yīng)。治療結(jié)束后，每組3只小鼠禁食6-8小時，然后用1%戊巴比妥(5毫克/千克，IP)麻醉，靜脈注射2-脫氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)100-200微居里(μCi)。注射18F-FDG30分鐘后，將小鼠固定在掃描架上，以進(jìn)行微正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET/CT)成像。選擇腫瘤外觀最大的圖像平面進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。手動繪制包含整個腫瘤的不規(guī)則感興趣區(qū)(ROI)。根據(jù)ROI，通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)攝取值，在衰減校正后的橫軸斷層切片中確定腫瘤的示蹤劑攝取值。從選定的ROI獲取最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)。