2材料與方法

2.1菌種、培養基和培養條件

土曲霉ATCC 20542用于生產洛伐他汀。除非另有說明，預培養基的制備方法如下。將兩個10天麥芽提取物斜面中的孢子洗到裝有300毫升預培養基(含一小部分培養基)的燒瓶中。每升中約有109個孢子。然后將孢子懸浮液分成兩個工作容積為150毫升的搖瓶。在30℃和110rpm的恒速旋轉振蕩器上預培養24小時。在選定的預培養物中加入規定量的碳酸鈣(平均直徑為10μm的微顆粒)，以誘導生長中的菌絲發生所需的形態變化。這些經過24小時培養的300毫升容積的預培養物被用作5.4升工作容積攪拌罐生物反應器的接種物(容積接種比為1:18)，該反應器以分批或連續分批補料模式運行。

在所有實驗中，生物反應器中的生產培養基都含有作為初始碳源的20克LAC(乳糖)和作為氮源的4克YE(酵母提取物)。在預培養基中，乳糖濃度為10g LAC/l，酵母提取物濃度為8g YE/l。培養基的詳細組成見其他文獻。在所有連續分批補料實驗中，生物反應器從48小時開始就以1.5毫升/小時的恒定補料速率加入甘油(500g GLY/l)溶液。所有生物反應器過程均在30℃溫度下進行。此外，生物反應器中的pH值從運行24小時起一直控制在7.8，并使用碳酸氫鈉和碳酸氫鉀溶液。定期添加盡可能低劑量的消泡劑A(Sigma)以防止起泡，起泡在24至48小時內最為嚴重。實驗分四批進行。

在第一批實驗中，批次培養(實驗T09和T10)的肉湯氧飽和度(pO2)設定為20%和40%，連續分批進行的培養(T01、T04和T06)的肉湯氧飽和度(pO2)設定為20%、35%和40%。采用級聯控制，首先改變空氣流速(從1.5升/分鐘到8升/分鐘)，然后改變攪拌速度(從175轉/分鐘到350轉/分鐘)。在某些實驗中，只用空氣流速控制pO2(見第3.3節)。

在第二批實驗(T01和T02)中，采用了不同的批次生物反應器工藝預培養準備方法。在T01試驗中，采用了上述標準方法。在T02實驗中，只將一個斜面上的孢子洗到裝有150毫升預培養基(含一小部分培養基)的燒瓶中。然后再加入150毫升無菌培養基。這樣總共有300毫升，分裝在兩個搖瓶中。如上所述，搖瓶在30℃和110轉/分的條件下培養。這一操作減少了孢子的數量，但沒有改變體積接種比。

在第三批實驗中，向標準預培養物中添加滑石微粒，濃度分別為9、12和15g/l(實驗T14、T15和T16)。在進行這一系列實驗的同時，還進行了不添加微顆粒的對照實驗(實驗T17)。

第四批實驗系列包括連續分批進行的補料運行，其中使用了滑石微顆粒(12克/升)進行預培養(實驗T21和T24-對照)。

2.2分析方法

用紙過濾器過濾從培養液中提取的樣品，用蒸餾水洗滌菌絲，在105℃溫度下烘干至恒重，以干重測定生物量(X)。使用液相色譜法測定過濾培養液中的乳糖、甘油(GLY)和洛伐他汀(LOV)濃度。分析前，樣品還需經過0.2μm過濾器凈化。使用Aquity RP18 1.7m(2×100mm)色譜柱在40℃溫度下檢測洛伐他汀。洗脫液(水-乙腈，均用0.1%甲酸酸化)流速為0.200ml/min，采用梯度洗脫：0.0-3.0min 60.0:40.0(v/v)3.0-7.0min 40.0:60.0(v/v)。在238納米波長處檢測洛伐他汀。乳糖和甘油在Aquity 1.7m(2.1×150mm)酰胺柱中測定，溫度為35℃。流速為0.290ml/min。等度洗脫，分析物由蒸發光散射檢測器檢測。

在靜態條件下，使用安裝在計算機控制的電動微機械手(Unisense)上的克拉克型氧氣微電極測量顆粒中的氧氣濃度曲線。從生物反應器中取出顆粒后迅速進行測量。對測量氧氣濃度曲線的顆粒進行數字拍照。然后，通過圖像分析確定其直徑。有關所有這些測量的詳細信息，包括所用方法的優點和局限性，已在以前的文章中作了介紹。

氧氣的對流傳質系數(kLa)和氧氣吸收率(OUR)是通過動態法測定的。