3結(jié)果

3.1肉湯中氧飽和度對洛伐他汀生物合成的影響

圖1、分批和連續(xù)分批補料實驗中培養(yǎng)基成分和工藝參數(shù)的時間變化，以顯示氧飽和度對洛伐他汀生物合成的影響：(A)分批運行中的洛伐他汀濃度，(B)連續(xù)分批補料運行中的洛伐他汀濃度，(C)攪拌速度，(D)間歇運行中的空氣流速，(E)連續(xù)分批補料運行中的空氣流速、(F)連續(xù)分批補料運行中的氧氣吸收率(OUR)和比氧氣吸收率(SOUR)；(G)分批運行中的乳糖濃度；(H)連續(xù)分批補料運行中的乳糖濃度；(I)T01、T04、T06、T09和T10試驗中獲得的連續(xù)分批補料運行中的甘油濃度。

氧氣是影響土霉菌中洛伐他汀形成的最重要因素之一。它有幾個作用。首先，洛伐他汀的形成需要分解代謝途徑中碳源的高強(qiáng)度氧化，以形成丙二酰CoA，丙二酰CoA是洛伐他汀非酮類合成酶(LNKS)延伸聚酮鏈的單位。其次，洛伐他汀形成過程中所謂的后PKS階段需要氧氣，即在氧合酶催化下，由LNKS合成的中間體4a,5-二氫洛奈可林進(jìn)行修飾。第三，真菌進(jìn)行有氧生長，通過氧化途徑消耗碳底物以產(chǎn)生能量。

在第一組實驗中，研究了氧飽和度(pO2)對生物反應(yīng)器中洛伐他汀生物合成的影響。圖1A和B顯示了在不同的pO2水平下，分批和連續(xù)分批補料生產(chǎn)時生產(chǎn)介質(zhì)中洛伐他汀濃度的變化。土霉菌生產(chǎn)的洛伐他汀受pO2的影響，在分批補料工藝(運行T04)中，當(dāng)pO2設(shè)為35%時，168小時的滴度為65mg LOV/l。在分批運行T10中，當(dāng)氧飽和度為40%時，洛伐他汀的滴度在120小時時達(dá)到69mg LOV/l，但隨后由于乳糖的缺乏，形成的產(chǎn)物被重新利用(圖1F)，在168小時時僅發(fā)現(xiàn)49毫克LOV/l。比較T09(pO2=20%)和T10(pO2=40%)兩個分批實驗，可以明顯看出，在72至120小時的運行期間，較高的氧飽和度有利于洛伐他汀的形成。另一方面，在pO2設(shè)為40%的甘油連續(xù)分批補料實驗(T06)中，洛伐他汀的滴度(約30毫克LOV/l)明顯低于pO2=40%的分批實驗，最終約6克GLY/l仍未在培養(yǎng)基中使用(圖1B和I)。

在這一組分批進(jìn)行的實驗中，T04的結(jié)果最好(69mg LOV/l)，其中pO2控制在35%，盡管肉湯中的洛伐他汀濃度直到96小時都低于T01(pO2=20%)。由于在所有實驗中肉湯中的氧飽和度都被控制在一個設(shè)定的水平，因此空氣流速(和攪拌速度，如果觀察到的話)的變化反映了土霉菌對氧氣的需求。圖1D和E顯示了選定運行的空氣流速。在分批補料運行(T01、T04和T06)中，補料開始時碳底物(甘油)供應(yīng)的增加導(dǎo)致空氣流速增加。

值得注意的是，與運行T09相比，分批運行T10對氧氣的需求要高得多，在該運行中，洛伐他汀的生產(chǎn)率很高，氧飽和度被控制在40%的最高水平(圖1D)。在所有運行的早期滋養(yǎng)階段(12小時左右)以及分批補料運行T01和T06中(pO2控制在40%)，氧氣吸收率非常高，以至于達(dá)到了空氣流速的上限，因此攪拌速度增加了(圖1C)。

在兩次分批補料實驗(T01和T04)中，氧氣需求量也用氧氣吸收率(OUR)和特定氧氣吸收率(SOUR)表示。這些速率隨時間的變化如圖1F所示。在設(shè)定了較高氧飽和度(35%)的實驗(T04)中，OUR和SOUR值均高于實驗T01。具體來說，晚期特異相中較高的OUR值與這一階段較高的洛伐他汀滴度相關(guān)(比較圖1B和F)。

在實驗T04、T06和T10中，為維持設(shè)定的pO2值而必須增加空氣流速和攪拌速度，這導(dǎo)致土霉菌從顆粒形態(tài)變?yōu)榉稚⑿螒B(tài)，這種變化影響了生物反應(yīng)器中肉湯的流變特性。當(dāng)出現(xiàn)分散形態(tài)時，生物反應(yīng)器壁上的停滯區(qū)清晰可見，這表明在這些運行過程中肉湯具有剪切變稀的行為。這些停滯區(qū)在T04試驗中尤為明顯，在該試驗中，由于較高的剪切力(pO2設(shè)置為35%)，在工藝開始時形成的蓬松(松散)顆粒后來轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⑿螒B(tài)。而在運行T01(pO2設(shè)為20%)時，流變學(xué)沒有發(fā)生這種變化：在工藝開始時形成的密度更大(更緊密)的顆粒在實驗后期沒有被破壞。在T01和T04試驗中，氧氣的對流傳質(zhì)系數(shù)(kLa)值與土曲霉的形態(tài)(顆粒狀或分散狀)相吻合。在T01運行中，當(dāng)顆粒占主導(dǎo)地位時，kLa在0.016到0.024s-1之間變化，而在T04運行中，當(dāng)分散形態(tài)占主導(dǎo)地位時，kLa在72到120小時之間在0.0036到0.0085s-1之間變化。

最后，碳底物濃度隨時間的變化取決于pO2的控制水平(圖1G-I)。在氧氣較多(pO2=40%)的批次運行T10中，乳糖較早被完全耗盡，而在運行T09(pO2=20%)中，乳糖一直留在肉湯中，直到實驗結(jié)束(圖1G)。在分批補料實驗T01和T04中，無論設(shè)定的氧飽和度如何，乳糖的利用率都差不多，尤其是在開始補料之前(圖1H)。在分批進(jìn)行的T06試驗(pO2=40%)中，乳糖的利用速度較慢，這可能是因為真菌形態(tài)發(fā)生了不利的變化，即由于機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致顆粒和菌絲破壞。與此同時，甘油的利用速度也很慢，從開始補料起就一直在積累。這些因素綜合在一起，導(dǎo)致本實驗的洛伐他汀產(chǎn)量相對較低。而其他兩次分批進(jìn)行的補料實驗則不同。在T04試驗中，所有添加的甘油幾乎全部被消耗，而在T01試驗中，甘油的濃度在試驗后期有所增加，達(dá)到約5.5g GLY/l。

總之，在分批生產(chǎn)過程中，較高的pO2值會加快碳底物(乳糖)的利用率，而眾所周知，這有利于洛伐他汀的形成。在分批式工藝中，40%的pO2水平是最佳的，但在補料式工藝中則不是。由于有更多的可用碳底物，在所有設(shè)定的pO2水平下，特別是在pO2=40%時(實驗T06)，分批補料運行的洛伐他汀滴度應(yīng)該會好得多。然而，這里的情況并非如此。在所有這些實驗中，除了真菌形態(tài)外，生物反應(yīng)器中的所有工藝條件都是完全可控的。由于生物反應(yīng)器中剪切應(yīng)力的增加，真菌形態(tài)發(fā)生了不良變化，從最初的顆粒狀變成了分散的菌絲碎片。這些變化主要發(fā)生在pO2設(shè)置為35%或40%的運行過程中。從理論上講，在這些實驗中，菌絲體獲得更多的氧氣應(yīng)該會提高洛伐他汀的滴度，但這并不像人們所期望的那樣明確。因此，我們進(jìn)行了一項實驗，研究洛伐他汀滴度與顆粒內(nèi)氧氣水平的關(guān)系。

3.2顆粒大小和結(jié)構(gòu)對連續(xù)補料工藝中顆粒中氧氣分布的影響

表1、實驗T01和T02(不同的培養(yǎng)前準(zhǔn)備)的顆粒內(nèi)氧氣濃度測量(每小時使用三個顆粒)。

圖2、生產(chǎn)培養(yǎng)基顆粒中的顆粒內(nèi)氧濃度曲線：(A)T01運行72小時后；(B)T01運行144小時后；(C)T02運行72小時后和(D)T02運行144小時后；帶箭頭的垂直線代表顆粒表面；這樣，邊界層中的氧濃度梯度與顆粒內(nèi)的梯度就區(qū)分開了。

在T01(見第3.1節(jié))和T02兩項連續(xù)分批進(jìn)行的實驗中，pO2控制在20%，以避免空氣流速和攪拌速度的大幅增加，從而將剪切應(yīng)力降至最低。這樣可以在生物反應(yīng)器中盡可能長時間地保持菌絲的顆粒結(jié)構(gòu)，并測量顆粒內(nèi)的氧氣濃度分布。此外，由于在預(yù)培養(yǎng)準(zhǔn)備過程中采用了不同的方法從斜面上清洗孢子(見第2.1節(jié))，在這兩次實驗中獲得的顆粒大小略有不同，但結(jié)構(gòu)卻大相徑庭。T02試驗中形成的顆粒稍小，結(jié)構(gòu)松散、蓬松。還能觀察到一些分散的菌絲。而T01試驗形成的顆粒則更為緊湊。在這兩次實驗中，顆粒形態(tài)一直保持到168小時，而第3.1節(jié)中描述的其他實驗則沒有這種情況。因此，可以在靜態(tài)條件下測定顆粒內(nèi)的氧氣濃度曲線(見第2.2節(jié))。需要注意的是，這些測量過程中的傳質(zhì)條件并不能準(zhǔn)確反映生物反應(yīng)器中的傳質(zhì)條件。因此，根據(jù)顆粒表面的氧氣濃度和顆粒內(nèi)部(即表面和中心之間)氧氣濃度的下降情況，對從T01和T02實驗中取出的顆粒進(jìn)行了簡化比較。表1顯示了所有這些結(jié)果。

對于在T02試驗中獲得的結(jié)構(gòu)松散的稍小顆粒，只有少數(shù)顆粒內(nèi)部的氧濃度降為零。而在T01試驗中獲得的結(jié)構(gòu)更緊湊的較大顆粒中，在不同培養(yǎng)時間測試的15個顆粒中有8個的氧氣濃度為零。此外，在T01試驗的顆粒中，從顆粒表面到中心的氧氣濃度(CO2)下降幅度(平均為1.9毫克O2/l)高于T02試驗的顆粒(平均為1.3毫克O2/l)。

圖2顯示了顆粒內(nèi)氧氣濃度分布的示例。在運行T02的結(jié)構(gòu)密度較低的顆粒中，氧氣深入顆粒內(nèi)部。這種情況在72小時內(nèi)尤為明顯，這對高效生產(chǎn)洛伐他汀至關(guān)重要。72小時時，通常是洛伐他汀生產(chǎn)率和乳糖利用率最高的時候，只有在T01運行的顆粒中，也就是在形態(tài)致密的顆粒中，氧氣濃度才降到零(圖2A和C)。當(dāng)乳糖成為限制條件時，兩次運行的顆粒中的氧濃度再次上升(圖2B、D和圖3B)，表明氧消耗速度減慢。在T02試驗中，氧濃度的增加高于T01試驗，這與肉湯中檢測到的乳糖含量較低有關(guān)(圖3B)。

圖3、在不同的培養(yǎng)前準(zhǔn)備和接種(T01和T02)實驗中，(A)洛伐他汀和(B)乳糖濃度的時間變化。

3.1顯示，通過提高肉湯中氧飽和度的設(shè)定水平，提高了洛伐他汀的生物合成。本節(jié)的結(jié)果表明，確保顆粒內(nèi)的高氧濃度也有利于提高洛伐他汀的滴度(圖3A)：168小時后，氧飽和度較高、顆粒較松散的T02試驗的洛伐他汀滴度比顆粒較緊湊的T01試驗高出25毫克LOV/l。

盡管稍小和較松散的顆粒對洛伐他汀滴度的增加作用不大，但我們的研究結(jié)果表明，控制真菌形態(tài)有利于土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀。因此，我們采用了微顆粒強(qiáng)化培養(yǎng)技術(shù)(MPEC)。