摘要

間歇性缺氧(IH)與阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)對心血管造成的后果有關。然而，由于缺乏合適的實驗系統，無法評估間歇性缺氧對內皮是有害、保護還是兩者兼有。這項工作的目的是確定IH氧合波動的頻率和幅度對主動脈內皮傷口愈合的影響。使用一種新型可控系統對人原代內皮細胞單層進行損傷和恒定充氧(1%、4%、13%或20%O2)或不同頻率(0.6、6或60次/小時)和幅度范圍(13-4%O2或20-1%O2)的IH，24小時后測量傷口愈合情況。細胞單層修復在20%氧氣和13%氧氣條件下相似，但在4%氧氣的持續低氧條件下顯著增加(約兩倍)。IH的幅度和頻率在很大程度上調節了傷口愈合。在最低頻率(0.6次/小時)下，13%-4%O2的循環可使內皮傷口愈合加快102%。然而，與13%-4%的氧氣振蕩相比，20%-1%氧氣振蕩的IH暴露會降低傷口閉合速度(在6個周期/小時和0.6個周期/小時時分別降低74%和44%)。模擬嚴重OSA的高頻IH模式(60次/小時)并未顯著改變內皮傷口的閉合，與氧合周期振幅無關。總之，間歇性缺氧IH中低氧循環的頻率和幅度會明顯改變傷口愈合反應，并成為決定細胞在OSA中如何反應的關鍵因素。

最新與值得關注

間歇性缺氧(IH)會對阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)患者的心血管造成影響。然而，以往在與OSA相關的實驗研究中采用的各種頻率和嚴重程度的IH導致了對IH影響結果的爭議。通過采用優化的IH實驗系統，我們提供的證據表明，間歇性缺氧IH的頻率和程度明顯改變了人體主動脈內皮的傷口愈合，成為決定細胞在OSA中如何反應的關鍵因素。

引言

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種非常普遍的呼吸系統疾病，可能會對神經認知、代謝、腫瘤和心血管造成不良后果。間歇性缺氧(IH)是由OSA患者上氣道反復塌陷和重新開放引起的，是這種夜間呼吸障礙的主要有害挑戰之一，與OSA的許多病癥有關。然而，IH也被認為是通過誘導和促進細胞和器官的預處理而起到潛在保護作用的因素。事實上，關于IH對心血管的具體影響一直存在著激烈的爭論。雖然IH會誘導釋放活性氧和炎癥介質，從而損害血管內皮功能，導致動脈粥樣硬化，但IH也可能通過激活以誘發預處理為重點的適應性反應來發揮心臟保護作用和治療作用。因此，關于持續氣道正壓療法(或CPAP)對OSA患者心血管影響的先驗結論相互矛盾，其原因可能在于IH的多態性，這一話題在過去幾年中引起了廣泛關注和爭論。盡管人們一直認為周期性缺氧的程度和頻率在IH對心血管系統的保護或損害作用中起著關鍵作用，但使天平傾向一方或另一方的IH特征的確切界限尚不清楚。

細胞培養是研究IH潛在影響的一種有價值的實驗方法，因為與動物模型不同，細胞培養可以選擇性地、精確地將細胞置于所選擇的IH模式下。然而，由于缺乏合適的實驗系統，無法在體外細胞中應用控制良好的IH模式，研究模仿OSA的IH如何調節細胞行為的工作一直受阻。最近，研究IH對細胞影響的方法學難題得到了解決，即在透氣薄膜上培養細胞，允許氧氣從膜下空間快速擴散到細胞。這種實驗方法可以在振幅和頻率方面對細胞應用精確控制的IH模式。鑒于我們有興趣研究控制良好的模擬OSA的IH對細胞的影響，并且有合適的實驗環境，本研究的目的是檢驗氧分壓變化的頻率和每個周期中達到的最大和最小氧值對細胞反應的特征起重要作用這一假設。更具體地說，我們使用一種模擬內皮修復的經典傷口閉合實驗來評估這一假設，并研究輕度和重度OSA對應的兩種實際IH頻率(分別為6次和60次呼吸暫停/小時)對損傷后內皮細胞單層修復的影響。對于每種頻率，我們還研究了兩種氧分壓高低范圍的影響：20%-1%的氧氣波動(這是基于IH的細胞研究中使用的原型)和13%-4%的氧氣波動(這相當于OSA患者主動脈內皮細胞所經歷的更真實的氧張力值)。事實上，在正常通氣和氣體交換條件下，如果沒有發生呼吸暫停事件，動脈血中的氧分壓(PaO2)約為100mmHg(即13%O2)。假設在嚴重OSA事件中動脈血氧飽和度(SaO2)可達到約60%的最低點，則相應的PaO2將為約30mmHg，相當于4%的氧氣。

方法

細胞培養。從美國類型培養物保藏中心(ATCC)獲得的人原代主動脈內皮細胞(HAEC)常規生長在血管細胞基礎培養基中，該培養基補充了內皮細胞生長試劑盒-VEGF(ATCC)和抗生素/抗真菌溶液，抗生素/抗真菌溶液的最終濃度為10U/ml青霉素、10g/ml鏈霉素和25g/ml兩性霉素B。實驗前，將細胞培養物保存在T-25組織培養瓶中，置于20%O2，5%CO2和37℃的標準加濕培養箱中。在使用下述體外系統進行實驗時，使用的是混合度為75%的第4和第5代培養物。

IH體外應用的實驗環境。在體外細胞暴露于恒定或可變氧氣濃度(IH)的實驗中，采用了一種定制的實驗裝置，該裝置由一個聚二甲基硅氧烷(PDMS)系統組成，該系統是根據之前的設計改良而成的。設計的裝置以直徑20毫米的PDMS孔為基礎，孔內有90μm厚的透氣PDMS膜(圖1A)。孔的底部與氣源相連，通過薄膜的直接擴散，使恒定的混合氣體或循環變化的氣體成分循環到膜頂部培養的細胞中。PDMS孔是用Autodesk 123D設計軟件設計的陰性聚乳酸模具制成的，并用Ultimaker-2 3D打印機打印出來。簡而言之，將PDMS混合物倒入陰模中，然后用真空罐去除氣泡，再將混合物放入65℃的烤箱中烘烤3小時，使PDMS固化，然后從模具上剝離PDMS，得到復制品。另一方面，PDMS膜是按照之前描述的方案在硅晶片上制作的。為了獲得90μm厚的膜，將PDMS混合物倒在晶片中心，以1,000rpm的轉速旋轉1分鐘。

圖1細胞暴露于恒定或可變氧氣濃度的體外實驗系統。A：對培養細胞進行受控間歇性缺氧(IH)的細胞培養設置示意圖(解釋見正文)。B：以60次/小時的頻率進行不同量級的IH(20-1%O2(藍線)和13-4%O2(黑線))時，在膜頂部(細胞培養層)測得的實際氧氣濃度。C：以60次/小時(黑線)和6次/小時(紅線)的頻率施加13-4%O2的IH時，在膜頂部(細胞培養層)測得的實際氧氣濃度。每個時間軸的顏色與相應的線相關聯。B和C中的信號在時間上有所偏移，以便于視覺比較。

為了確認氣體刺激在頻率和振幅方面從氣體攪拌器正確傳遞到培養細胞，所有用于體外實驗的培養系統都在使用前進行了校準。使用氧氣微傳感器(Unisense)測量膜頂部(細胞培養層)的氧氣濃度顯示，系統平衡時間約為7秒，從而驗證了應用不同IH模式(包括模擬OSA的高頻模式)時實驗設置的正確顯示(圖1，B和C)。如圖所示，改變氧氣失飽和的頻率會改變失飽和和再飽和的持續時間。雖然這種IH模型并不能完全模擬OSA患者在不同呼吸暫停指數下的實際缺氧/復氧時間，但它再現了大多數IH實驗中的循環模式。