我們在硫胺素治療24小時后進行了HSPC移植(每個受者約105個系-cKit+Sca1+(LKS)細(xì)胞)，并在18-24小時后測量了每個進入鈣基底膜的LKS細(xì)胞周圍的pO2。我們得到的pO2值幾乎涵蓋了化療后(升高的)BM pO2的整個范圍(圖3c)，這表明HSPC并沒有尋找由低pO2定義的特定壁龕作為優(yōu)先歸巢的位置。

這些觀察結(jié)果促使我們重新研究血液流動在BM中的情況。具體來說，我們想知道，在nestin+與nestin-血管中觀察到的pO2差異，以及在穩(wěn)定狀態(tài)與放療/化療動物中觀察到的pO2差異，是否至少可以部分地通過血流曲線來解釋。我們注射了CFSE標(biāo)記的紅細(xì)胞(RBC)，并將成像速度提高到每秒120幀(掃描1/4幀)，以便跟蹤單個RBC的流動方向和速度。有趣的是，在nestin+血管中觀察到的紅細(xì)胞流速最高(>2毫米/秒，而在正弦血管中為0.2-1毫米/秒)。血管網(wǎng)絡(luò)圖顯示，nestin+血管總是位于竇狀血管的上游，并向竇狀血管排水(圖4a)，這表明nestin+血管具有動脈特征。熒光抗Sca-1抗體的體內(nèi)免疫染色證實它們是動脈(擴展數(shù)據(jù)圖7a)。

使用標(biāo)記的紅細(xì)胞進行血流成像還有助于克服放療/化療后染料泄漏的問題，并使我們能夠通過分析視頻序列中流動紅細(xì)胞的軌跡來劃分功能性血管。我們發(fā)現(xiàn)，在致命性照射后2-6天(擴展資料圖7b和擴展資料視頻1)，紅細(xì)胞的流動出奇地旺盛，而此時紅細(xì)胞的細(xì)胞活力正急劇下降(擴展資料圖8)。充足的血液供應(yīng)和減少的氧消耗(減少的骨髓細(xì)胞活力)可以解釋放療和化療后pO2升高的原因。細(xì)胞減少也可以解釋為什么骨髓抑制調(diào)理后血管內(nèi)和血管外pO2梯度消失。

為了進一步確定細(xì)胞活力與耗氧量之間的聯(lián)系，我們將來自GFP供體小鼠的25×106個總骨髓細(xì)胞輸注到接受致死性照射的DsRed受體中(圖4b)。我們在第2天和第5天通過FACS驗證了大部分增殖(Ki-67+)細(xì)胞都在供體部分(圖4c)。然后，通過體內(nèi)成像，我們發(fā)現(xiàn)骨髓中包含供體(GFP+)和受體(DsRed+)細(xì)胞的異質(zhì)斑塊，局部pO2存在相應(yīng)差異(圖4b)。較低的pO2與大群綠色細(xì)胞有關(guān)，這與增殖細(xì)胞更熱衷于消耗氧氣的觀點一致(圖4d)。

總之，直接測量血液中的絕對pO2揭示了一個獨特的缺氧景觀，即血管密集(供氧)和細(xì)胞密集(耗氧)。供氧和耗氧之間的平衡會因放療和化療等壓力而改變。局部地形是由基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)不同類型血管的定位進一步確定的(擴展數(shù)據(jù)圖9)。特別是，靠近nestin+動脈的造血干細(xì)胞和靠近竇狀血管的造血干細(xì)胞將經(jīng)歷不同的代謝環(huán)境，這凸顯了進一步研究不同血管龕在造血干細(xì)胞調(diào)控中的作用的必要性。

方法

雙光子pO2顯微鏡

顯微鏡由兩個激發(fā)臂組成：一個視頻速率激光掃描雙光子成像臂和一個點檢測雙光子磷光壽命傳感臂(擴展資料圖1)。調(diào)諧到840或913nm的80MHz飛秒激光源的輸出通過偏振分束器(PBS1)分為s偏振和p偏振。s偏振光束穿過PBS1進入成像臂，而p偏振光束則偏轉(zhuǎn)90°進入點檢測臂。每個臂的功率可通過旋轉(zhuǎn)PBS1前面的半波板進行調(diào)節(jié)。這些偏振光束隨后在進入物鏡前由第二個偏振分光鏡(PBS2)重新組合。

在點檢測臂上，光束利用振鏡掃描儀(6220H)掃過狹縫孔徑(NT38-560)，然后成像到樣品上，形成一條~3.5μm的掃描線。這種一維掃描同時達(dá)到兩個目的。首先，它產(chǎn)生了一個脈沖持續(xù)時間可調(diào)(15-40微秒)的激發(fā)門，由狹縫孔徑上的掃描速度決定。其次，它可以減少可能伴隨靜態(tài)激發(fā)的三重態(tài)飽和效應(yīng)，從而有助于防止軸向點擴散函數(shù)的退化。使用激發(fā)門后，使用定制的光子計數(shù)電路記錄單個磷光光子的到達(dá)時間。然后分析光子到達(dá)時間的直方圖，以獲得三重態(tài)的壽命。我們發(fā)現(xiàn)pO2測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差通常低于4mmHg，并且與信噪比(SNR，數(shù)據(jù)未顯示)成反比。

對于成像臂，我們使用了與之前描述的類似的掃描引擎，并使用PBS2將光束與點檢測臂結(jié)合在一起。然后，光束由工作距離為280μm的60×1.2 NA水浸式無窮遠(yuǎn)校正近紅外鍍膜物鏡聚焦。

PtP-C343的描述和校準(zhǔn)

PtP-C343中的雙光子天線香豆素343(擴展數(shù)據(jù)圖3)在840納米波長處的雙光子吸收截面(σ2)約為28GM，熒光量子產(chǎn)率φfl)約為0.90。這意味著PtPC343的雙光子作用截面(η=σ2φfl)約為25.2GM。C343和PtP的FRET效率(?FRET)約為0.68。在無氧條件下，PtP-C343的磷光壽命(τ0)約為60μs，其動態(tài)范圍非常適合pO2的生理范圍。為了進行校準(zhǔn)，我們在體外38℃、pH值為7.4的PtP-C343緩沖溶液中記錄了由氧電極(OX-500，UnisenseA/S，擴展數(shù)據(jù)圖2)獨立記錄的pO2范圍內(nèi)的壽命測量值。我們的結(jié)果與已公布的同一批染料的曲線相吻合(擴展數(shù)據(jù)圖2)。

動物制備

所有程序均已獲得麻省總醫(yī)院機構(gòu)動物護理和使用委員會(IACUC)的批準(zhǔn)。所有體內(nèi)PtPC343實驗均使用年齡小于6個月的雄性野生型C57BL/6J(杰克遜實驗室)和C57BL/6 Nes-GFP小鼠。在典型實驗中，通過吸入1.35%-2%異氟醚和氧氣的混合物緩慢誘導(dǎo)小鼠麻醉。為維持麻醉狀態(tài)，將混合氣體降至1.25%異氟醚和98.75%氧氣。該方案最大程度地減少了麻醉對組織pO2的影響。通過頭皮上的U形切口暴露髑髏骨，以創(chuàng)建皮瓣，并在頭皮上放置2%的甲基纖維素凝膠以進行折射率匹配。

然后，給小鼠靜脈注射100-180μl懸浮于0.9%磷酸鹽緩沖鹽水中的1.7mM PtP-C343，以及40-60μl 10mg/ml 70kDa RhodamineB-Dextran。我們使用了相對較多的PtP-C343，以便在血管外達(dá)到足夠的濃度，進行間質(zhì)pO2測量。如前所述，將小鼠置于加熱平臺上，頭骨置于物鏡下方。每次成像時掃描小鼠顱骨約4×6mm的區(qū)域，包括左右額骨內(nèi)大部分矢狀旁BM腔，并選擇適當(dāng)位置進行pO2測量。與之前的體內(nèi)研究一致，使用PtP-C343探頭沒有觀察到明顯的毒性或光毒性。成像結(jié)束后，用6-0線縫合頭皮，讓小鼠蘇醒。在最終實驗中，小鼠會因脊髓脫落或二氧化碳安樂死而死亡。

在分析血管大小與骨內(nèi)膜表面距離的函數(shù)關(guān)系時，我們注意到，距離骨表面20-40μm和>40μm的血管普遍比0-20μm區(qū)域大，平均直徑分別為27.0μm和26.9μm(p分別<0.002和0.06，圖2a)。距離骨表面大于40μm的區(qū)域構(gòu)成了密集的正弦血管網(wǎng)絡(luò)，與靠近骨表面的血管相比，其形狀更不規(guī)則(圖2a)。