體內(nèi)pAM34生長試驗(yàn)：

為了比較傷寒沙門氏菌在約氏瘧原蟲感染動物和模擬感染動物體內(nèi)的大致生長率，小鼠周身接種1×109CFU傷寒沙門氏菌invA spiB CmR+pAM34(GTW58)。正如之前所描述的，pAM34質(zhì)粒的復(fù)制受LacI抑制區(qū)的控制，當(dāng)沙門氏菌在高濃度乳糖或乳糖類似物（如IPTG）中生長時，LacI抑制區(qū)可使質(zhì)粒復(fù)制并維持，但當(dāng)細(xì)菌在低乳糖環(huán)境（如成年小鼠）中分裂時，質(zhì)粒無法復(fù)制并迅速丟失。因此，質(zhì)粒在種群水平上的丟失與細(xì)菌在低乳糖環(huán)境中的整體復(fù)制情況相關(guān)，從而可以評估復(fù)制率。

為了制備鼠傷寒沙門氏菌CmR+pAM34的接種體，將在添加了羧羧苯西林（0.1mg/ml）和1mM IPTG（用于維持質(zhì)粒）的LB上生長的單菌落接種到LB肉湯（僅添加IPTG）中，并在37°C下振蕩（200rpm）培養(yǎng)12小時。然后，將質(zhì)粒稀釋到不含IPTG的新鮮LB中進(jìn)行亞培養(yǎng)（1:100），以更好地評估早期復(fù)制率。感染小鼠后，立即用PBS對接種體進(jìn)行連續(xù)稀釋，并將其培養(yǎng)在MacConkey和MacConkey+Carb+1mM IPTG上，以量化含pAM34的鼠傷寒桿菌與接種的鼠傷寒桿菌總數(shù)之比。接種后4或24小時，小鼠被安樂死，收集腸道內(nèi)容物并將其接種到MacConkey上，以量化鼠傷寒桿菌的負(fù)擔(dān)并確定維持pAM34的種群比例。在小鼠感染的同時，將接種物的系列稀釋液在LB中再培養(yǎng)4到24小時，然后分別接種在MacConkey和MacConkey+Carb+IPTG上，以生成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將群體水平的pAM34質(zhì)粒丟失與復(fù)制次數(shù)相關(guān)聯(lián)，如前所述。

體外pH值細(xì)菌存活試驗(yàn):

為了評估細(xì)菌對低pH值的敏感性，用鹽酸將PBS酸化到2到5之間的不同pH值，然后將其等分到不同的試管中。鼠傷寒沙門氏菌Nissle1917、O157：H7EDL933(ATCC 43895)、輪狀芽孢桿菌DBS100(ATCC 51459)、福氏志賀氏菌M90T(ATCC BAA-2402)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌亞種。在LB肉湯中培養(yǎng)過夜后，按上述方法準(zhǔn)備接種小鼠，但要用PBS代替LB洗凈并重懸，使600納米波長處的光密度（OD600）達(dá)到1.0，然后上漿以量化初始CFU。然后將接種物以1:100的比例稀釋到不同的低PH值的PBS管中，在37°C下振蕩培養(yǎng)1小時。用新鮮的PBS（pH值為7.4）對樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，然后將其滴在MacConkey瓊脂上，以量化剩余細(xì)菌的濃度。

胃pH評估:

小鼠安樂死后，從體腔中取出胃。立即將pH針電極PH-N和參比探針（Unisense）插入未經(jīng)處理的胃前腔以評估pH值，記錄Unisense PH微電極萬用表上的測量值（單位：毫伏），并利用同時讀取pH值為2、4和7的參比標(biāo)準(zhǔn)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將其轉(zhuǎn)換為pH值。在兩次測量之間，用70%的乙醇和蒸餾水沖洗探針。

組胺H2R激動劑（地馬普利）給藥:

如前所述，給小鼠接種感染了約氏瘧原蟲的血液或?qū)φ昭８腥竞蟮?天上午，小鼠接受單劑量組胺H2R激動劑地馬普利二鹽酸鹽或用載體進(jìn)行模擬處理。地馬普利以0.1毫升溶于無菌生理鹽水的二鹽酸地馬普利（40毫克/毫升）的形式腹腔注射，而載體（生理鹽水）以同等體積注射。一小時后，用鼠傷寒桿菌挑戰(zhàn)小鼠4小時，然后評估胃pH值和腸道鼠傷寒桿菌負(fù)荷。

奧美拉唑給藥:

按照之前的描述，給小鼠接種約氏瘧原蟲感染的血液或?qū)φ战M血液。感染后第3、4和5天的下午，小鼠開始每天接受質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑或載體的模擬治療。奧美拉唑以0.1毫升懸浮液（30毫克/毫升）的形式腹腔注射于杜氏磷酸鹽緩沖鹽水中的1%吐溫80中，而藥物則以同等體積注射。6dpp時，用鼠傷寒桿菌攻擊小鼠24小時，然后評估胃pH值和腸道鼠傷寒桿菌負(fù)荷。

抗腫瘤壞死因子-α抗體給藥:

如前所述，給小鼠接種感染了約氏瘧原蟲的血液或?qū)φ昭８腥竞蟮?天和第5天，給小鼠注射超葉純化的抗小鼠腫瘤壞死因子的TNF-α抗體或超葉純化大鼠免疫球蛋白IgG1，同型對照抗體。兩種抗體均在dPBS中稀釋至2毫克/毫升，每只小鼠腹腔注射0.25毫升，劑量為每只小鼠0.5毫克（約25毫克/千克體重）。6dpp時，對小鼠實(shí)施安樂死以進(jìn)行相關(guān)測量，或用鼠傷寒桿菌攻擊小鼠3小時，然后實(shí)施安樂死以進(jìn)行胃pH值和腸道鼠傷寒桿菌負(fù)荷測量。

RNA提取和實(shí)時PCR表達(dá)分析:

在去除內(nèi)腔內(nèi)容物后，在尸檢時將組織速凍在液氮中，并保存在-80°C溫度下。使用TRI試劑從組織中分離RNA。簡言之，將整個組織懸浮于TRI試劑中，用玻璃珠振打1分鐘使其均質(zhì)，然后用氯仿處理并離心分離各相。取出水相并與95%的乙醇混合，然后應(yīng)用硅膠膜柱，并用3M乙酸鈉洗滌。用PureLinkDNase處理柱子以去除基因組DNA污染，并用70%乙醇中的10mM Hepes洗兩次，然后用無RNase水洗脫RNA以進(jìn)行定量分析。

胃組織病理學(xué)：

在尸體解剖時，按照Sigal等人的描述，沿著小彎將胃剖開，從林胃到幽門括約肌收集中線處約5毫米寬的大彎樣本，并用石蠟包埋以生成縱向切片。從福爾馬林固定的石蠟包埋組織中切取5微米厚的組織切片，由加州大學(xué)戴維斯分校獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行H&E染色。使用EVOSFL成像顯微鏡對染色切片進(jìn)行明視野（20×）和自發(fā)熒光（40×）掃描，以進(jìn)行一般組織病理學(xué)評估和高嗜酸性（自發(fā)熒光）細(xì)胞定量。

為了評估胃粘膜中嗜酸性粒細(xì)胞的豐度以估算頂細(xì)胞的豐度，對林胃與胃竇交界處遠(yuǎn)端組織的腺體/粘膜部分的圖像進(jìn)行了人工劃界，并使用ImageJ測量了腺體面積。然后，對圖像進(jìn)行二值化處理，填充孔洞，使用分水嶺分離附近的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并對大顆粒（半徑大于25微米）進(jìn)行分析。由于這一過程經(jīng)常會將多個緊密相連的頂細(xì)胞歸為單個顆粒，因此通過將每張圖像中的顆粒面積除以整體顆粒大小的中位數(shù)，將分析的顆粒轉(zhuǎn)換為近似的細(xì)胞數(shù)。

血漿腫瘤壞死因子TNF-α測量：

小鼠吸入二氧化碳死亡后，立即用肝素化針進(jìn)行心臟穿刺采集血液。肝素化血液經(jīng)離心（8000g，4分鐘）后，去除血漿層并保存在-80°C溫度下，按照生產(chǎn)商的說明使用測定小鼠腫瘤壞死因子。

統(tǒng)計分析：

除組織病理學(xué)分析外，研究人員在實(shí)驗(yàn)和結(jié)果評估過程中對動物的分配不設(shè)盲區(qū)。樣本量根據(jù)以往研究的效應(yīng)大小估算。所有分析均使用Prism8進(jìn)行。培養(yǎng)鼠傷寒桿菌載量的檢測限設(shè)定為100CFU/g，每克腸道內(nèi)容物中的CFU數(shù)經(jīng)過log10轉(zhuǎn)換，使數(shù)據(jù)歸一化，以便進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間對數(shù)10歸一化的CFU數(shù)量、胃pH值和對數(shù)2歸一化的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的顯著差異通過韋爾奇校正的非配對t檢驗(yàn)確定。同一動物體內(nèi)競爭性鼠傷寒桿菌菌株的CFU量的顯著差異通過配對t檢驗(yàn)確定。組間競爭指數(shù)及其他比較前未對數(shù)歸一化的指標(biāo)（體重變化、脾胃重量、血細(xì)胞計數(shù)、寄生蟲負(fù)荷和循環(huán)TNF-α）的顯著性差異通過Mann-Whitney檢驗(yàn)確定。在所有比較中，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。