摘要：

冠狀動脈疾病（CAD）患者的特點是血管再生能力下降，這與內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的功能障礙有關。G-蛋白偶聯(lián)受體4（GPR4）是一種質(zhì)子傳感G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），有助于酸性微環(huán)境中的血管新生。然而，GPR4在調(diào)節(jié)CAD患者的EPCs對缺血組織中產(chǎn)生的酸性的血管生成能力方面所起的作用仍完全不清楚。

評估了從CAD患者和健康人體內(nèi)采集的EPC在不同pH值環(huán)境下的血管生成能力。在體外和體內(nèi)分析了GPR4調(diào)節(jié)EPC介導的血管生成的功能。通過基因過表達和抑制進一步研究了其下游機制。

酸性環(huán)境預刺激可顯著增強非CAD組EPCs在體內(nèi)和體外的血管生成能力，而同樣的處理方法在CAD組中卻產(chǎn)生了相反的結(jié)果。在四種典型質(zhì)子感應GPCR中，GPR4在EPCs中的表達量最高。CAD患者的EPCs中GRP4的表達明顯低于非CAD患者的EPCs，與酸刺激無關。siRNA介導的GPR4敲除以及STAT3磷酸化的降低模擬了CAD患者的EPCs在pH6.4而非pH7.4下的功能受損。通過激活STAT3/VEGFA信號，提高GPR4的表達可恢復CAD患者的EPCs在酸性環(huán)境中介導的新血管形成。此外，阻斷STAT3/VEGFA信號通路會減弱GPR4上調(diào)對EPC介導的血管生成能力的有益影響。

本研究首次證明，GPR4的缺失是導致CAD患者EPCs質(zhì)子感應和血管生成能力下降的原因。增強GPR4的表達可通過激活STAT3/VEGF信號促進EPCs新血管的形成。這一發(fā)現(xiàn)表明，GPR4是治療以缺血組織血管新生能力受損為特征的CAD的潛在靶點。

引言:

冠狀動脈疾病（CAD）是全球死亡的主要原因。冠狀動脈部分或完全堵塞引起的供血中斷會導致心肌缺血、心肌梗死（MI）以及隨后的功能衰退。通過新血管的有效發(fā)育恢復心肌缺血部位的血液供應可減少心肌壞死，并大大改善CAD患者的預后。先前的研究表明，內(nèi)皮祖細胞（EPCs）通過招募到缺血部位并促進血管再生，有助于心肌損傷的修復。然而，EPC在缺血微環(huán)境中介導新生血管形成的控制機制在很大程度上仍然未知。

由于灌注不良，無氧糖酵解在代謝過程中占主導地位，并導致乳酸和H+濃度增加，從而導致缺血部位局部酸中毒。哺乳動物冠狀動脈結(jié)扎模型表示pH值從7.4降至5.5。因此，CAD患者的EPC在進入缺血部位時會暴露在酸性微環(huán)境中。酸性微環(huán)境可能會導致細胞外基質(zhì)降解、減弱免疫反應并改變細胞和細胞間的信號傳遞。酸性細胞外pH值對血管生成過程有多方面的影響。最近的研究表明，酸性預處理可大大提高缺血部位內(nèi)皮集落形成細胞的存活率和血管生成活性。然而，損傷組織內(nèi)遷移的和局部的EPC對酸性的反應性較差，這又限制了CAD患者心肌缺血部位血管再通的進行。

G蛋白偶聯(lián)受體4（GPR4）是一種pH感知型G蛋白偶聯(lián)受體，在血管內(nèi)皮細胞中高表達，可被缺血微環(huán)境中的質(zhì)子激活。先前的研究表明，GPR4可在酸性pH值下促進血管生成，并能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的管形成、遷移和增殖。GPR4基因敲除小鼠的血管形態(tài)發(fā)生改變，血管長度和密度減少。此外，GPR4缺失會導致內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGF2）水平降低。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮細胞介導的血管再生需要GPR4。然而，人們對GPR4是否介導缺血組織中產(chǎn)生的酸性反應和CAD患者EPCs的血管生成能力知之甚少。

在本研究中，我們假設GPR4是調(diào)節(jié)EPC細胞外pH響應的重要標志物，而GPR4表達的升高可以改善CAD患者EPC的血管生成功能。針對這些假設，研究人員評估了健康對照組和CAD患者的EPC上GPR4的表達水平。然后，在增強EPCs中GPR4的表達后，對其在裸鼠后肢缺血模型中的體外功能和體內(nèi)血管生成能力進行了檢測。從化學生物學的新視角來看，本研究可能發(fā)現(xiàn)GPR4是缺血組織中EPC酸性微環(huán)境的關鍵傳感器，可作為預防和治療CAD的靶標。

材料與方法:

外周血單核細胞（PBMNC）的分離、后期EPC培養(yǎng)和流式細胞術(shù)分析:

如前所述，PBMNCs是通過Ficoll密度梯度離心從健康人和CAD患者身上分離出來的，而晚期EPCs則是按照所述方案培養(yǎng)和鑒定的。簡言之，將PBMCs培養(yǎng)在纖維粘連蛋白涂層的6孔板上，EBM-2（內(nèi)容物：抗壞血酸0.5ml、rhFGF-B 2.0ml、肝素0.5ml、GA-1000 0.5ml、rhEGF 0.5ml、氫化可的松0.2ml、VEGF 0.5ml、R3-IGF-1 0.5ml），輔以內(nèi)皮生長培養(yǎng)基-SingleQuots。在所有檢測中，晚期EPC都是在第3期（約28天）用培養(yǎng)基完全洗凈后使用的。28天后，使用CD31、Tie-2受體（BD Biosciences）和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體（KDR）分別從健康人和CAD患者體內(nèi)分離的EPC均在37°C和5%CO2的EBM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每48小時更換一次。

體外晚期EPC血管生成：

采用Matrigel管樣形成試驗測定EPC的血管生成能力。將Matrigel和EGM-2培養(yǎng)基在37°C、5%CO2條件下在96孔板中聚合1小時。每個條件組包含3個孔。最后觀察細胞，用光學顯微鏡拍攝圖像。用ImageJ軟件評估網(wǎng)絡面積和長度。同樣，用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和siRNA處理酸處理的EPC，然后進行Matrigel實驗。

體外EPC遷移的后期：

EPC遷移是通過傷口愈合試驗確定的。在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2×105個P2代EPC。用p20移液管吸頭手動刮除細胞單層，用PBS溶液清洗一次，然后加入2毫升EBM-2，形成傷口。在37°C下培養(yǎng)24小時后，計數(shù)移行的細胞。同樣，用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和siRNA處理酸處理的EPCs，然后進行傷口愈合實驗。

酸刺激：

為制備等壓pH培養(yǎng)基，首先用7.5-mM HEPES緩沖EGM-2，然后用pH微電極（Unisense，丹麥奧胡斯）測量培養(yǎng)基的pH值，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)到所需的pH值。為制備合適的培養(yǎng)基，常規(guī)EGM-2培養(yǎng)基在含5%CO2或20%CO2的濕潤組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少1小時。之后，測量每種培養(yǎng)基的pH值，分別約為7.4和6.4。

EPC基因轉(zhuǎn)移：

培養(yǎng)28天后，用編碼人GPR4基因的pcDNA3.1(+)（pcDNA3.1(+)-GPR4）、載體（pcDNA3.1(+)H302）或增強型綠色熒光蛋白基因（H312 pEGFP-N1）轉(zhuǎn)染細胞。H312 pEGFP-N1僅用于熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)Western印跡和后續(xù)實驗確定，pcDNA3.1(+)-GPR4或載體均不含增強型綠色熒光蛋白基因。用pcDNA3.1(+)-GPR4、載體（pcDNA3.1(+)H302）或H312 pEGFP-N1在無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)導人EPC90分鐘。轉(zhuǎn)導后，用PBS沖洗細胞并用酸性培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，然后用于后續(xù)實驗。

siRNA轉(zhuǎn)染：

使用Lipofectamine®RNAiMAX試劑按照生產(chǎn)商的方案用5μlGPR4-siRNA或5μlscramblesiRNA轉(zhuǎn)染EPCs48小時，然后用酸性培養(yǎng)基處理。轉(zhuǎn)導后，用PBS沖洗細胞并用酸性培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，然后進行后續(xù)實驗。