結(jié)果

急性糖酵解抑制引起的神經(jīng)元參數(shù)變化

圖1抑制海馬體切片糖酵解時(shí)的代謝和電參數(shù)。A：a)在CA1區(qū)，2-DG(7mM 15mM葡萄糖，抑制糖酵解約35%)降低了刺激Schaffer支脈誘發(fā)的eLFPs(施加2-DG后40分鐘)。然而，在一個(gè)切片中，eLFPs沒有減少，并顯示出多個(gè)次級尖峰(見插圖)，表明網(wǎng)絡(luò)興奮性過高；b)2-DG減少了CA1(n=6，P<0.001)和齒狀回(n=4，P<0.03)；=(c)2-DG引起靜息膜電位(Em；n=8，P＜0.01)和GABA介導(dǎo)的電流反轉(zhuǎn)電位(EGABA；n=6，P＜0.05)的去極化。B：2-DG還降低了CA1(n=6，P＜0.001)和齒狀回(n=4，P＜0.03)對突觸刺激(10Hz，10秒)反應(yīng)的(a)(b)NAD(P)H瞬態(tài)和(c)驟降/過沖比顯著增加，與糖酵解受抑制一致。C：2-DG能明顯降低突觸刺激時(shí)的耗氧量。D：a)0.1mM 2,4-二硝基酚(DNP)抑制線粒體呼吸誘導(dǎo)靜息膜電位(Em；n=9，P<0.01)和EGABA(n=8，P<0.001)，通過單個(gè)NMDA和GABA受體通道的細(xì)胞附著貼片記錄測量L2/3錐體細(xì)胞；b)將ACSF葡萄糖濃度降至0.2mM(n=6，Em和EGABA分別為P<0.05和0.01)也可獲得類似的效果。兩種情況下細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的降低程度相似。

在海馬切片中，施用7mM 2-DG會誘發(fā)CA1和齒狀回層的局部場電位(eLFPs)(圖1Aa)逐漸降低(分別降低了49%±5%，n=6，P<0.01和25%±6%，n=4，P<0.03；圖1Ab)。

然而，在一個(gè)CA1切片中，eLFPs沒有減少，反而在2-DG作用下表現(xiàn)出多個(gè)次級群體尖峰，這表明網(wǎng)絡(luò)亢奮(見圖1Aa插圖)。此外，重復(fù)性突觸刺激(10赫茲，10秒)顯示了2-DG對網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)的不規(guī)則影響，eLFP總積分在對照組的114%和42%之間變化(平均值為76±12，n=6，P=0.099)。同時(shí)，在齒狀回顆粒細(xì)胞中，使用桔皮素穿孔貼片技術(shù)測量2-DG應(yīng)用1小時(shí)后，2-DG誘導(dǎo)了Em(從-87.6±2.3到-73.3±1.5mV，n=8，P＜0.01)和EGABA(從-85.8±3.1到-76.6±2mV，n=6，P＜0.05)的顯著去極化。這些效應(yīng)并非2-DG所特有，可以通過其他抑制能量代謝的方法再現(xiàn)，如將ACSF葡萄糖濃度降至0.2mM或使用氧化磷酸化抑制劑二硝基苯酚(0.1mM)(圖1D，單通道記錄)。

在CA1和齒狀回中，2-DG改變了NAD(P)H在重復(fù)性突觸刺激(10赫茲，10秒，圖1Ba、b)下的自發(fā)熒光瞬態(tài)："浸潤"(氧化)和"過沖"(還原)兩種瞬態(tài)成分的振幅都減小了，而NAD(P)H的浸潤/過沖比值顯著增加(圖1Bc；CA1和DG信號分別為n=6，P<0.001和n=4，P<0.03)，這證實(shí)糖酵解受到了抑制。2-DG也顯著降低了刺激誘導(dǎo)的CA1耗氧量(圖1C)。NAD(P)H熒光和耗氧量的減少可能并不是因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)對刺激的反應(yīng)受到抑制，因?yàn)樗袑?shí)驗(yàn)中都觀察到了這兩個(gè)參數(shù)的減少，甚至那些應(yīng)用2-DG后整體反應(yīng)(訓(xùn)練eLFP積分)增加的實(shí)驗(yàn)也是如此。

因此，在切片中對糖酵解的急性抑制可使神經(jīng)元去極化并降低GABA能抑制，從而提高突觸后興奮性，但同時(shí)也可能降低興奮性突觸傳遞的功效。據(jù)推測，2-DG對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性的這些相反作用可以調(diào)和在體內(nèi)報(bào)告的2-DG促沖動和抗驚厥急性效應(yīng)。

慢性糖酵解抑制引發(fā)體內(nèi)癲癇發(fā)生

圖2長期抑制腦糖酵解會誘發(fā)大鼠癲癇。在自由活動的大鼠中，每天靜脈注射2-DG會導(dǎo)致陣發(fā)性活動的發(fā)生。A：一只大鼠在2-DG處理前(藍(lán)色跡線)和處理后(紅色跡線)的代表性LFP記錄；插圖(箭頭)清楚地顯示了靜止期振蕩活動的差異。B：a)A中所示LFP記錄的功率譜密度(PSD)；b)在記錄過程中導(dǎo)致一只大鼠死亡的強(qiáng)直陣攣發(fā)作的例子。

為了研究2-DG在體內(nèi)的長期影響，我們記錄了自由活動的大鼠在通過每天靜脈注射2-DG直接抑制腦糖酵解(10只大鼠接受2-DG治療，8只大鼠接受空白對照治療)前后的腦部活動。在2-DG治療4周后，我們在2只大鼠中檢測到了密集的自發(fā)性癲癇發(fā)作活動(平均次數(shù)分別為42.3次/小時(shí)和26.6次/小時(shí)，平均持續(xù)時(shí)間分別為57.9秒和38.6秒)，而在其他2-DG治療大鼠或空白對照大鼠中均未檢測到癲癇發(fā)作活動。圖2A顯示了這兩只大鼠中的一只在2-DG治療4周前后記錄到的代表性LFP。插圖顯示了短時(shí)間的"靜止"基線活動，在治療前(左圖)存在明顯的θ節(jié)律振蕩，而在2-DG治療后(右圖)這種活動被完全破壞。事實(shí)上，服用2-DG后，低頻(以及主導(dǎo)頻率的轉(zhuǎn)換)和高頻的信號功率都顯著增加(圖2Ba)。

圖2 C：注射35毫克/千克PTZ后測量2-DG/空白處理前(藍(lán)色/黑色跡線)和處理后(紅色/灰色跡線)的平均癲癇嚴(yán)重程度。D：各組大鼠在治療前后的平均功率譜密度(均歸一化為總PSD積分)(2-DG組10只，空白載體組5只)。在Δ頻率范圍(1-4Hz)，PSD峰值在2-DG作用下明顯變小。E：2-DG治療強(qiáng)烈增加了各組所有大鼠的平均累積活動。F：2-DG治療增加了LFP高振幅尖峰(尖波，在50至990毫秒時(shí)間范圍內(nèi)測量)和(G)高頻爆發(fā)(HFBs；在100至250赫茲范圍內(nèi)測量；詳見方法)的數(shù)量。

經(jīng)2-DG處理的無自發(fā)性癲癇發(fā)作的大鼠(n=8)也表現(xiàn)出神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動異常。如圖2D所示，經(jīng)歸一化處理的平均PSD(所有大鼠；每只大鼠的PSD均歸一化為總PSD積分)顯示，經(jīng)2-DG處理的大鼠在Δ范圍頻率(1-4Hz)的功率顯著降低。此外，這些動物還表現(xiàn)出一種過度活躍的網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)，表現(xiàn)為"超基底"活動的顯著增加，即振幅超過基底水平的信號。此類事件可能由不同類型的生理或病理活動觸發(fā)，其累積水平可作為網(wǎng)絡(luò)興奮性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。我們計(jì)算了所有LFP記錄中連續(xù)20秒的累積活動(見方法)，并對各組大鼠的累積活動進(jìn)行了平均(圖2E)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-DG處理后LFP累積活動顯著增加，表明誘發(fā)的陣發(fā)性活動水平很高。處理還導(dǎo)致高振幅尖峰的數(shù)量顯著增加(從每10分鐘記錄10.9±4.0到29.2±12.8，n=10；P<0.02；圖2F)。此外，2-DG還能誘導(dǎo)產(chǎn)生在60至250Hz頻率范圍內(nèi)檢測到的多個(gè)高頻尖峰(從每10分鐘記錄4.2±1.9到32±14.5，n=10；P<0.01；圖2G；參見"方法"中的"LFP分析")。癲癇患者和動物癲癇模型的腦電圖中都曾出現(xiàn)過HFBs，它們被認(rèn)為反映了與癲癇發(fā)生相應(yīng)的病理活動。PTZ癲癇發(fā)作試驗(yàn)(評估神經(jīng)組織興奮性的變化)顯示，2-DG處理的大鼠癲癇發(fā)作閾值降低(圖2C)。共有三只經(jīng)2-DG處理的大鼠死亡，其中一只是因?yàn)樵谟涗涍^程中強(qiáng)直-陣攣發(fā)作(圖2Bb)，另外兩只是在夜間死亡(可能也是由于癲癇發(fā)作)。這些事件以及記錄的參數(shù)和分析有力地證明，2-DG確實(shí)會誘發(fā)網(wǎng)絡(luò)過度興奮，導(dǎo)致自發(fā)性癲癇發(fā)作。

總之，這些結(jié)果清楚地表明，長期抑制糖酵解會導(dǎo)致類似癲癇發(fā)生的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常狀態(tài)。