不同的CcoN亞基在菌落發(fā)育的早期或晚期對競爭適應(yīng)性是必需的

為了進(jìn)一步測試CcoN4對生物膜生長的貢獻(xiàn)，我們進(jìn)行了競爭實(shí)驗(yàn)，其中△N4和其他突變體與野生型一起作為混合菌株生物膜生長。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)菌株用組成型表達(dá)的YFP標(biāo)記，以便在菌落形成單位（CFUs）計(jì)數(shù)期間區(qū)分菌株。實(shí)驗(yàn)在每種菌株上標(biāo)記進(jìn)行，以確認(rèn)YFP表達(dá)不影響適應(yīng)性（圖3-圖補(bǔ)充1A,B）。當(dāng)在菌落生長3天后評估競爭適應(yīng)性時(shí)（圖3A），ΔN4細(xì)胞顯示出劣勢，野生型以兩倍的優(yōu)勢勝過ΔN4。這與在AN1AN2突變體中觀察到的劣勢相似，進(jìn)一步表明孤兒亞基CcoN4在生物膜代謝中起重要作用。

圖3 CcoN4在生物膜中具有競爭優(yōu)勢，尤其是當(dāng)O2成為限制條件時(shí)。(A)與WT在混合菌株生物膜中共同培養(yǎng)3天后，各種YFP標(biāo)記的cco突變體的相對適應(yīng)性。(B)顯示各種cco突變體與WT在混合菌株生物膜中共同培養(yǎng)3天的相對適應(yīng)性的時(shí)間過程。圖中顯示的是WT與各種"標(biāo)記"菌株(即設(shè)計(jì)為組成型表達(dá)YFP的菌株)共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(已標(biāo)記的WT與未標(biāo)記的突變體共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3-圖補(bǔ)充1)。誤差條代表生物三倍體的標(biāo)準(zhǔn)偏差。(C)通過薄片和DIC顯微鏡評估WT和Δphz的菌落生物膜在3天發(fā)育過程中的厚度變化。開始起皺后，測定基部(即皺紋之間的"谷")的厚度。(D)生物膜形成最初3天內(nèi)選定時(shí)間點(diǎn)的菌落O2曲線。灰色點(diǎn)標(biāo)記表示在菌落正下方的瓊脂中進(jìn)行的測量。

DIC成像顯示野生型菌落薄切片在深度上存在形態(tài)變化，這可能是由于O2可用性降低所致（圖3-圖補(bǔ)充1C）。我們先前報(bào)道過，3天齡的PA14菌落生物膜在深處是缺氧的（Dietrich et al.,2013），并且在較薄的生物膜（如吩嗪缺失突變體Aphz形成的生物膜）中O2可用性通常更高。我們提出，在野生型生物膜中利用吩嗪作為電子受體使缺氧區(qū)的細(xì)胞生存成為可能，并促進(jìn)菌落生長（Okegbe et al.,2014）。△N4突變體在競爭分析中相對較晚出現(xiàn)的表型（圖3B）使我們推測CcoN4可能在缺氧菌落亞區(qū)形成期間的生存中起作用，并且該區(qū)域可能在菌落生長1到2天之間出現(xiàn)。我們測量了野生型和Aphz生物膜在發(fā)育過程中特定時(shí)間點(diǎn)的O2濃度。

含CcoN4的異構(gòu)體對PA14毒力具有獨(dú)特貢獻(xiàn)

我們之前已經(jīng)證明，一個(gè)在生物膜特異性吩嗪生產(chǎn)中缺陷的突變體（其菌落形態(tài)也發(fā)生改變（Dietrich et al.,2008;2013））表現(xiàn)出毒力下降（Recinos et al.,2012）。我們和其他人提出，吩嗪可能通過作為電子受體在感染期間遇到的缺氧條件下平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)來促進(jìn)毒力（Price-Whelan et al.,2006;Newman,2008;Dietrich et al.,2013）。由于CcoN4是野生型生物膜結(jié)構(gòu)和呼吸作用所必需的（圖2A、C和圖5C），我們假設(shè)它也可能有助于毒力。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用線蟲秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為宿主進(jìn)行了毒力測定。研究表明，銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲具有致病性，并且緩慢致死模型模擬了細(xì)菌對秀麗隱桿線蟲的類似感染性殺死（Tan et al.,1999）。雖然△N1AN2以類似野生型的動(dòng)力學(xué)殺死線蟲，但△N1ΔN2ΔN4和△cco1cco2相對于野生型PA14表現(xiàn)出同樣受損的殺死能力（圖6）。

圖6含CcoN4的同工酶對PA14的毒力有獨(dú)特貢獻(xiàn)WT、gacA和各種cco突變株在線蟲秀麗隱桿線蟲中的緩慢殺滅動(dòng)力學(xué)。暴露于WT PA14的秀麗隱桿線蟲群體在接觸該細(xì)菌4天后幾乎100%死亡，而缺乏GacA(一種控制銅綠假單胞菌毒力基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子)的突變體則顯示殺滅率下降，暴露后4天仍有約50%的蠕蟲存活。(A)與WT相比，ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2的致病性明顯減弱。誤差條代表至少6個(gè)生物重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。暴露后2.25天，ΔN1ΔN2ΔN4殺死的elegans明顯少于WT(非配對雙尾t檢驗(yàn)；p=0.0022)。(B)與WT相比，ΔN1ΔN2的致病性僅略有降低。暴露后2.25天，ΔN1ΔN2殺死的elegans明顯多于ΔN1ΔN2ΔN4(非配對雙尾t檢驗(yàn)；p=0.003)。誤差條代表至少4個(gè)生物重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)重復(fù)的起始樣本量為30-35個(gè)蠕蟲。

討論

生物膜形成通常與宿主的定植和在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在相關(guān)，包括在囊性纖維化患者中觀察到的慢性肺部定植（Tolker-Nielsen,2014;Rybtke et al.,2015）。生物膜微環(huán)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的條件與充分混合的液體培養(yǎng)物中的條件在電子供體和受體可用性方面是不同的。我們先前描述了由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的電子穿梭抗生素吩嗪在生物膜特異性代謝中的作用。在本研究中，我們關(guān)注銅綠假單胞菌編碼cbb3型細(xì)胞色素氧化酶亞基的大量基因補(bǔ)體，并著手測試它們對生物膜中代謝電子流的貢獻(xiàn)。

銅綠假單胞菌基因組包含四個(gè)不同的ccoN同源物，編碼cbb3型氧化酶的催化亞基。其中只有兩個(gè)（ccoN1和ccoN2）與編碼活性cbb3型氧化酶另一關(guān)鍵成分的ccoO同源物共轉(zhuǎn)錄（圖1B）。然而，遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明，在銅綠假單胞菌PAO1中，所有四個(gè)版本的CcoN都可以在表達(dá)時(shí)與兩個(gè)CcoO同源物中的任何一個(gè)形成功能性復(fù)合物（Hirai et al.,2016）。在充分混合的液體培養(yǎng)物中，缺乏“孤兒”亞基的突變體沒有顯示出生長缺陷（圖2C）（Hirai et al.,2016）。因此，我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，在菌落生物膜分析中，△N4突變體顯示出獨(dú)特的形態(tài)（圖2A，圖2-圖補(bǔ)充1A）。我們在研究細(xì)胞氧化還原平衡和感應(yīng)的機(jī)制時(shí)廣泛使用了該分析，并注意到△N4的表型類似于電子穿梭和氧化還原信號缺陷突變體的表型（Dietrich et al.,2013;Okegbe et al.,2017）。

我們通過一系列分析表征了ΔN4突變對生物膜生理學(xué)的影響。在充分混合的液體培養(yǎng)物中，Dcco1cco2顯示出與DN1AN2相似的生長表型。雖然Hirai等人已證明在浮游生長條件下，野生型銅綠假單胞菌培養(yǎng)物確實(shí)形成含有CcoN4的Cco異質(zhì)復(fù)合物，但我們的觀察表明，這些復(fù)合物在這些條件下對生長的貢獻(xiàn)不顯著。與此一致，在ΔN1ΔN2背景中刪除ccoN4對浮游生長沒有影響（圖2C）。然而，在基于生物膜的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)刪除N4就足以引起形態(tài)表型的改變（圖2A和圖2-圖補(bǔ)充1A），并且在DN1或AN1AN2背景中刪除N4深刻影響了生物膜生理學(xué)。這些實(shí)驗(yàn)包括對菌落呼吸活性的量化，其中刪除CcoN4導(dǎo)致顯著降低（圖2B）；生物膜共培養(yǎng)，其中CcoN4是競爭適應(yīng)性所必需的（圖3A和B，圖3-圖補(bǔ)充1）；氧化還原分析，顯示CcoN4可以促進(jìn)吩嗪還原（圖5B，上圖）；菌落厚度測量，顯示CcoN4是缺氧和缺氧區(qū)形成所必需的（圖5B，下圖）；以及基質(zhì)分析，顯示CcoN4有助于抑制Pel多糖的產(chǎn)生（圖5C）。在菌落薄切片中觀察到的cco1、cco2和ccoN4Q4在表達(dá)區(qū)域上的重疊（圖4）意味著CcoN4可以與Cco1和Cco2亞基形成跨越菌落深度的異質(zhì)復(fù)合物，并以這些方式影響銅綠假單胞菌生物膜的生理學(xué)。

圖4 cco基因隨生物膜深度的不同而表達(dá)不同。左圖：從生長了3天的WT生物膜中制備的薄切片的代表性圖像。每個(gè)生物膜都在cco1、cco2或ccoN4Q4啟動(dòng)子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)譯GFP報(bào)告基因。報(bào)告熒光顯示為綠色，并覆蓋在相應(yīng)的DIC圖像上。右圖與左側(cè)圖像相對應(yīng)的熒光值。各圖中均減去了含有g(shù)fp基因但無啟動(dòng)子的菌株(空MCS對照)的熒光值。圖中還顯示了生長3天的WT生物膜的O2濃度隨深度變化的情況(開放圓圈)。

本研究報(bào)告的突變體表型和基因表達(dá)譜表明了CcoN4在生物膜特定環(huán)境下對O2和吩嗪還原的作用，并使我們能夠?qū)ζ渌鸆coN亞基的作用得出結(jié)論。ccoN4Q4在整個(gè)生物膜深度上的表達(dá)表明含CcoN4的異構(gòu)體可能參與有氧和缺氧區(qū)域的細(xì)胞色素c氧化（圖4）。這偏離了先前發(fā)表的觀察結(jié)果，即與充分通氣的液體培養(yǎng)物相比，這些基因在缺氧液體培養(yǎng)物中特異性誘導(dǎo)（Alvarez-Ortega and Harwood,2007）。因此，我們在菌落相對含氧的上部區(qū)域觀察到的ccoN4Q4表達(dá)可能是生物膜特有的。

AN4顯示出表明氧化還原應(yīng)激的菌落形態(tài)，并且與野生型相比具有適應(yīng)性劣勢（圖2A和圖3A,B，圖5B下圖，圖3-圖補(bǔ)充1）。然而，由于它在吩嗪還原方面沒有缺陷（圖5B，上圖），我們將其菌落形態(tài)和受損的適應(yīng)性表型歸因于其在O2還原中提出的作用（Hirai et al.,2016）。類似地，ΔN1ΔN2顯示出相對于野生型的適應(yīng)性降低（圖3A和B，圖3-圖補(bǔ)充1），同時(shí)顯示出與野生型相當(dāng)?shù)姆脏哼€原（圖5B），這意味著其中一個(gè)或兩個(gè)亞基有助于生物膜中的O2還原。然而，當(dāng)CcoN4與CcoN1和CcoN2一起被刪除時(shí)，所得菌株表現(xiàn)出嚴(yán)重的吩嗪還原缺陷，刪除兩個(gè)cco操縱子重現(xiàn)了這一表型（圖5B）。因此，我們的觀察表明cbb3型氧化酶在吩嗪還原中的作用，除了其已確立的O2還原作用之外，從而擴(kuò)展了我們對它們在銅綠假單胞菌生理學(xué)和生存中整體貢獻(xiàn)的理解。

圖5 PA14 WT和突變體菌落生物膜中化學(xué)梯度和基質(zhì)分布的特征。(A)左圖：生長兩天的WT和Δphz生物膜的氧氣濃度(藍(lán)色)和氧化還原電位(橙色)隨深度的變化。WT生物膜厚約150μm，而Δphz生物膜厚約80μm。對于O2曲線，誤差條代表生物三重樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于氧化還原曲線，數(shù)據(jù)代表至少5個(gè)生物重復(fù)。右圖：描述生物膜中O2和還原與氧化酚嗪類分布的模型。(B)頂部：生長2天的WT和各種突變生物膜的氧化還原電位隨深度的變化。至少5個(gè)生物重復(fù)的數(shù)據(jù)具有代表性。下圖所述菌株3天菌落生物膜的厚度。(C)左圖：WT和cco突變體生物膜的代表性薄切片，用凝集素染色并用熒光顯微鏡成像。生物膜在取樣前已生長2天。右圖凝集素染色信號強(qiáng)度的相對量化。左側(cè)面板中菌株名稱的顏色為繪制數(shù)據(jù)提供了一個(gè)關(guān)鍵，右側(cè)面板中的y軸為左側(cè)面板提供了一個(gè)刻度條。凝集素染色圖像和數(shù)值代表4個(gè)生物重復(fù)。

這里描述的結(jié)果可以啟發(fā)我們理解細(xì)胞如何在生物膜微環(huán)境內(nèi)的不同條件下生存。先前的工作表明，丙酮酸發(fā)酵可以支持銅綠假單胞菌在缺氧條件下的生存（Eschbach et al.,2004），并且吩嗪促進(jìn)這一過程（Glasser et al.,2014）。額外的研究表明，吩嗪還原是由銅綠假單胞菌黃素蛋白和脫氫酶偶然催化的（Glasser et al.,2017）。我們觀察到cbb3型細(xì)胞色素氧化酶，特別是含有CcoN1或CcoN4亞基的那些，是在缺氧生物膜亞區(qū)吩嗪還原所必需的（圖5B），這進(jìn)一步將電子傳遞鏈與這些化合物的利用聯(lián)系起來。考慮到吩嗪在細(xì)胞色素bc1復(fù)合物和細(xì)胞色素氧化酶的生化研究歷史上作為介導(dǎo)劑的作用，這也很有趣（King,1963;Armstrong and Stewart-Tull,1971;Davidson et al.,1992）。基于這些早期工作，我們可以推測不同的CcoN亞基可能間接影響吩嗪還原，這可能發(fā)生在CcoO亞基的細(xì)胞色素c結(jié)合位點(diǎn)或電子傳遞鏈的其他地方，通過這些CcoN亞基對呼吸復(fù)合物的整體功能或穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。最終，在不同的生物膜深度或取決于電子供體可用性，吩嗪還原和吩嗪相關(guān)代謝的各種機(jī)制可能都是相關(guān)的。我們的結(jié)果表明，在菌落生物膜系統(tǒng)中，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是O2還原特異性的酶復(fù)合物可能有助于厭氧生存。

由于生物膜形成通常與宿主的定植和持續(xù)存在相關(guān)，我們測試了CcoN4是否有助于銅綠假單胞菌在秀麗隱桿線蟲中的致病性。類似于我們在生物膜分析中的觀察，我們發(fā)現(xiàn)Acco1cco2突變體比ΔN1ΔN2突變體表現(xiàn)出更嚴(yán)重的表型，表明孤兒亞基可以替代由cco1和cco2操縱子編碼的亞基。我們還發(fā)現(xiàn)在ΔN1ΔN2中刪除ccoN4導(dǎo)致了類似Dcco1cco2的表型，表明CcoN4是可以發(fā)揮這一作用的亞基（圖6）。在O2可用的宿主微環(huán)境中，含CcoN4的異構(gòu)體可能有助于其還原。此外，在缺氧區(qū)域，含CcoN4的異構(gòu)體可能促進(jìn)吩嗪還原，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞氧化還原平衡。這兩種功能都將有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在。cbb3型氧化酶對銅綠假單胞菌致病性的貢獻(xiàn)提出了干擾Cco酶功能的化合物可能成為這些感染有效療法的可能性。由于它們對細(xì)菌呼吸鏈的特異性，此類藥物將是極具吸引力的候選藥物，因此不會影響宿主的內(nèi)源性呼吸酶。

我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)孤兒cbb3型氧化酶亞基有助于生物膜生長，這進(jìn)一步擴(kuò)展了銅綠假單胞菌顯著呼吸靈活性的范圍。除了末端酶復(fù)合物水平的模塊性（例如利用aa3-型與cbb3-型氧化酶），銅綠假單胞菌呼吸鏈的活性還受到孤兒cbb3型催化亞基替代天然亞基的進(jìn)一步影響。利用含CcoN4的異構(gòu)體促進(jìn)了吩嗪還原活性，并可能影響銅綠假單胞菌生物膜中的有氧呼吸。對于包含孤兒cbb3型催化亞基的特殊物種來說，這種精細(xì)的控制水平在覆蓋廣泛電子受體可用性范圍的環(huán)境（Cowley et al.,2015）中生長和生存可能特別有利。