摘要

研究目的：阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的特點(diǎn)是間歇性缺氧和氧化應(yīng)激。然而，模擬OSA的間歇性缺氧是否會(huì)改變男性的生育能力尚不清楚。我們?cè)谛∈竽Ｐ椭袦y(cè)試了慢性間歇性缺氧模擬OSA會(huì)降低男性生育能力的假設(shè)。

設(shè)計(jì)：在小鼠模型中進(jìn)行病例對(duì)照比較。

環(huán)境：大學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室。

參與者：18只F1(C57BL/6xCBA)雄性小鼠。

干預(yù)：對(duì)小鼠進(jìn)行為期60天、每天6小時(shí)的周期性缺氧(20秒5%氧氣濃度，然后40秒室內(nèi)空氣濃度)或常氧。60天后，小鼠進(jìn)行交配試驗(yàn)，通過評(píng)估懷孕雌鼠和胎兒的數(shù)量來確定有效生育力。

測(cè)量和結(jié)果：安樂死后，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶1(Gpx1)和超氧化物歧化酶1(Sod1)的表達(dá)，評(píng)估睪丸的氧化應(yīng)激。精子活力由精液綜合分析系統(tǒng)(ISAS)測(cè)定。間歇性缺氧明顯增加了睪丸的氧化應(yīng)激，與常氧相比，Gpx1和Sod1的表達(dá)分別減少了38.9%和34.4%(P<0.05)。間歇性缺氧組的精子活力從常氧時(shí)的27.0±6.4%顯著下降到12.8±1.8%(P=0.04)。間歇性缺氧組的妊娠雌性比例和每次交配的胎兒數(shù)(分別為0.33±0.10和2.45±0.73)明顯低于常氧對(duì)照組(分別為0.72±0.16和5.80±1.24)。

結(jié)論：這些結(jié)果表明，與阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)相關(guān)的間歇性缺氧可能會(huì)導(dǎo)致患有這種睡眠呼吸障礙的男性患者生育力下降。

引言

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種普遍存在的慢性疾病，尤其是男性。其特點(diǎn)是在睡眠過程中反復(fù)發(fā)生上氣道完全或部分塌陷。這些呼吸事件會(huì)導(dǎo)致間歇性低氧血癥、胸內(nèi)負(fù)壓升高和睡眠破碎。OSA對(duì)心血管、新陳代謝、神經(jīng)認(rèn)知以及最近的腫瘤等方面的影響已在實(shí)驗(yàn)和臨床層面得到廣泛研究和證實(shí)。間歇性缺氧引發(fā)的全身和器官特異性氧化應(yīng)激被認(rèn)為在OSA中長(zhǎng)期后果的形成中扮演了關(guān)鍵角色。

在一個(gè)完全不同的背景下，人們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是導(dǎo)致越來越多男性不育的主要原因。事實(shí)上，吸煙、酗酒、接觸毒素、炎癥過程或多種慢性疾病都會(huì)導(dǎo)致全身性氧化應(yīng)激增強(qiáng)，從而降低男性生育能力。特別是嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)功能障礙，如慢性阻塞性肺病或肺泡蛋白沉積癥，與全身低氧血癥有關(guān)，也與睪丸功能損害有關(guān)。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，在特發(fā)性男性不育(約占50%)病例中，精液中活性氧(ROS)的產(chǎn)生量較高，抗氧化能力較低。此外，有證據(jù)表明，精子膜上的多不飽和脂肪酸極易被ROS過氧化，而脂質(zhì)過氧化可導(dǎo)致精子形態(tài)改變。事實(shí)上，通過量化ROS或總抗氧化能力來評(píng)估精液氧化應(yīng)激是男性不育的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，而低抗氧化能力與精子參數(shù)不良有關(guān)。

鑒于OSA會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激，而這種挑戰(zhàn)會(huì)降低男性的生育能力，因此可以預(yù)計(jì)OSA的一個(gè)潛在后果可能會(huì)導(dǎo)致患有這種睡眠呼吸障礙的男性患者的生育能力下降，尤其是在發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重的缺氧事件的嚴(yán)重病例中。雖然最近有理論依據(jù)提出男性生育力低下、肥胖和OSA之間存在聯(lián)系，但目前既沒有臨床數(shù)據(jù)也沒有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證實(shí)這種潛在的復(fù)雜關(guān)系。為了驗(yàn)證OSA誘導(dǎo)的缺氧事件會(huì)降低男性生育能力的假設(shè)，我們對(duì)一個(gè)模仿OSA的慢性間歇性缺氧小鼠模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。具體來說，我們研究了間歇性缺氧是否會(huì)誘發(fā)睪丸組織缺氧/再缺氧事件、增強(qiáng)睪丸氧化應(yīng)激并導(dǎo)致精子活力下降。此外，我們還進(jìn)行了交配試驗(yàn)，以確定在模擬嚴(yán)重OSA患者的間歇性缺氧模式下，小鼠的雄性生育能力是否真的會(huì)下降。

材料與方法

動(dòng)物。這項(xiàng)研究獲得了巴塞羅那大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象是44只無病原體的F1(C57BL/6xCBA)雄性小鼠。這些小鼠被關(guān)在標(biāo)準(zhǔn)籠子里，自由飲用自來水和進(jìn)食，并飼養(yǎng)在溫度和光照受控的房間里(22-24oC，12L：12D)。

應(yīng)用慢性間歇性缺氧的系統(tǒng)。慢性間歇性缺氧是通過先前描述過的一種設(shè)置來實(shí)現(xiàn)的。簡(jiǎn)言之，通過一個(gè)基于多孔的分配系統(tǒng)，持續(xù)的氣流在一個(gè)盒子(長(zhǎng)26厘米、寬18厘米、高6厘米)中循環(huán)。放置在箱體入口附近的氣動(dòng)閥從室內(nèi)空氣入口(40秒)循環(huán)切換到含氧量為5%的低氧空氣儲(chǔ)氣罐(20秒)。因此，對(duì)放置在盒子中的小鼠施加的間歇性缺氧頻率相當(dāng)于每小時(shí)60次呼吸暫停，這代表了嚴(yán)重的OSA。為了讓對(duì)照組小鼠接受常氧呼吸，將這些小鼠放入與間歇性缺氧箱相同的箱中，但用室內(nèi)空氣代替5%O2的儲(chǔ)氣罐。因此，兩組小鼠的實(shí)驗(yàn)方案完全相同，唯一的區(qū)別是呼吸常氧或間歇性缺氧空氣。

睪丸缺氧/復(fù)氧測(cè)量。在第一組實(shí)驗(yàn)中，我們確定了呼吸間歇性缺氧空氣是否會(huì)導(dǎo)致睪丸缺氧復(fù)氧。我們對(duì)六只12周大的小鼠進(jìn)行了麻醉(20%氨基甲酸乙酯，1克/千克)，測(cè)量了睪丸組織氧分壓(PtO2)。剃除并清潔腹部下層皮膚后，在陰莖下方做一橫向切口以暴露睪丸。在陰囊和睪丸鞘膜處做第二個(gè)最小切口，將快速反應(yīng)克拉克極譜氧微電極UnisenseA/S；直徑50μm)插入睪丸表面下3毫米處。獲得穩(wěn)定的基線記錄后，用鼻罩間歇性缺氧15分鐘。氧微電極測(cè)量PtO2的時(shí)間進(jìn)程，該微電極連接到一個(gè)放大的微微安培計(jì)(Unisense A/S)，該微微安培計(jì)先前在水中以100%O2、21%O2和無氧溶液(NaOH 0.1M、抗壞血酸鈉0.1M)進(jìn)行過校準(zhǔn)，并記錄了PtO2的時(shí)間進(jìn)程(MicOX軟件，UnisenseA/S)。動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)也是通過脈搏血氧儀測(cè)量和記錄的。

間歇性缺氧對(duì)睪丸氧化應(yīng)激和精子活力的影響。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)系列旨在評(píng)估間歇性缺氧30天對(duì)幼鼠睪丸組織氧化應(yīng)激和精子活力的影響。為此，將20只小鼠(12w大)隨機(jī)分為兩組(對(duì)照組和間歇性缺氧組；每組n=10只)并稱重(常氧組和間歇性缺氧組的體重分別為25.5±0.6g和26.0±0.3g)。將動(dòng)物放入實(shí)驗(yàn)籠中，每天在光照時(shí)間段(10：00-16：00)對(duì)其進(jìn)行6小時(shí)的間歇性缺氧或常氧，光照時(shí)間段相當(dāng)于嚙齒動(dòng)物的睡眠時(shí)間。在間歇性缺氧或常氧條件下飼養(yǎng)30天后，小鼠被處以安樂死。將精子從附睪中釋放出來，進(jìn)行常規(guī)精液圖檢查，以測(cè)量總活力和漸進(jìn)活力值。此外，還對(duì)精子活力和精子數(shù)量進(jìn)行了分析。為了評(píng)估精子的運(yùn)動(dòng)能力和漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)能力，需要切除睪丸、附睪和輸精管。從輸精管上切除脂肪和靜脈，以避免污染。此外，還切除了睪丸并將其保存在-80oC下，以通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶1(Gpx1)、超氧化物歧化酶1(Sod1)和過氧化氫酶(Cat)。

通過精液造影測(cè)量精子活力。用鑷子從附睪尾部向輸精管末端施加軟壓力，將精子放入裝有500μL M2培養(yǎng)基的35毫米孔中。精子樣本在37oC培養(yǎng)15分鐘，直到精子均勻分布在M2滴中。從液滴表面取25μL樣品(上游動(dòng))放在顯微載玻片上，以獲得定量的精子活力變量。使用精液綜合分析系統(tǒng)分析精子運(yùn)動(dòng)和精子漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)測(cè)量結(jié)果。該分析使用的參數(shù)包括平滑路徑速度、軌跡速度、直線度(直線速度/平均路徑速度之比，VSL/VAP)和側(cè)頭擺動(dòng)幅度，這些參數(shù)基于總運(yùn)動(dòng)、漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)和速度(靜態(tài)、中速和慢速精子細(xì)胞)。精子計(jì)數(shù)時(shí)，將精子樣本用毫升水稀釋1/10，然后將10μL精子放入Bürker室中，按照標(biāo)準(zhǔn)程序獲得精子細(xì)胞濃度(百萬(wàn)精子/毫升)。使用活/死精子存活率試劑盒，結(jié)合活細(xì)胞核酸染色法SYBR-14和傳統(tǒng)的死細(xì)胞核酸染色法碘化丙啶，測(cè)定活精子細(xì)胞和死精子細(xì)胞的存活率。簡(jiǎn)言之，將0.8mL 20mM SYBR-14工作溶液和1.2mL 2.4mM碘化丙啶工作溶液加入50mL精子懸浮液(2-3×106個(gè)精子細(xì)胞/mL)中，37oC培養(yǎng)15分鐘。15分鐘后，將20mL精子懸浮液裝入玻璃載玻片，蓋上蓋玻片，并立即在裝有適當(dāng)濾光片的熒光顯微鏡下觀察。SYBR-14可將活精子的細(xì)胞核染成綠色，而死精子或膜損傷的精子則會(huì)被碘化丙啶染成紅色。