研究簡(jiǎn)介:在完整的腦中，存在一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)來(lái)協(xié)調(diào)能量底物的輸送，并根據(jù)神經(jīng)元的能量代謝需求調(diào)整能量底物池的組成。然而，在體外的腦切片實(shí)驗(yàn)中，這種復(fù)雜的系統(tǒng)并不存在，神經(jīng)元的能量供應(yīng)完全依賴于實(shí)驗(yàn)條件。因此，確保實(shí)驗(yàn)條件盡可能接近體內(nèi)情況是體外研究的首要要求，其中氧氣供應(yīng)是關(guān)鍵因素之一。標(biāo)準(zhǔn)人工腦脊液（ACSF）中僅含有葡萄糖作為能量底物，但體內(nèi)腦組織中的能量底物池可能更為復(fù)雜，包括乳酸等其他底物。本論文主要研究了腦切片中能量代謝的臨界狀態(tài)，重點(diǎn)探討了氧氣輸送和能量底物在塑造神經(jīng)元活動(dòng)中的關(guān)鍵作用。研究人員使用了P19至P44的瑞士小鼠海馬腦切片。通過(guò)施加不同頻率的刺激，記錄局部場(chǎng)電位（LFPs）和NAD(P)H熒光變化，同時(shí)測(cè)量切片組織中的氧分壓（pO2）。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)改變灌流速率（4ml/min和15ml/min）來(lái)研究氧氣供應(yīng)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的影響，并比較了在標(biāo)準(zhǔn)ACSF和富含能量底物的ACSF（eACSF，包含葡萄糖、丙酮酸、β-羥基丁酸等）中的神經(jīng)元活動(dòng)和能量代謝。本研究表明，腦切片中的神經(jīng)元活動(dòng)和能量代謝對(duì)氧氣供應(yīng)極為敏感，且在高氧氣供應(yīng)下，其他能量底物可以增強(qiáng)神經(jīng)元的氧化代謝和功能。然而，在氧氣供應(yīng)不足時(shí)，這些底物的效果大打折扣。因此，在體外腦切片實(shí)驗(yàn)中，確保充足的氧氣供應(yīng)和合理選擇能量底物對(duì)于模擬體內(nèi)神經(jīng)元活動(dòng)至關(guān)重要。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測(cè)量腦切片組織中的氧分壓（pO2）。具體使用的是Clark式氧氣微電極，其尖端直徑為10微米。該微電極連接到PA2000主機(jī)上，用于精確測(cè)量切片組織中的氧氣濃度。使用了兩點(diǎn)校準(zhǔn)法，將電極插入33°C的生理鹽水溶液中，分別在95%氧氣或環(huán)境空氣中平衡，以校準(zhǔn)電極。氧氣微電極被放置在與場(chǎng)電位記錄電極相近的位置，用于測(cè)量局部組織氧分壓的變化。通過(guò)Unisense微電極，研究人員能夠?qū)崟r(shí)、高精度地測(cè)量切片組織中的氧分壓，采集到的數(shù)據(jù)用于分析氧氣供應(yīng)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的影響，特別是在不同灌流速率下氧氣分布的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

研究結(jié)果證實(shí)，在急性腦組織切片中，決定神經(jīng)元興奮性的基本神經(jīng)元參數(shù)與氧化能代謝密切相關(guān)。我們還表明，能量代謝狀態(tài)對(duì)切片組織中氧氣的可用性高度敏感。這個(gè)ATP合成途徑在腦組織切片中顯然受到了損害，因此神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)氧濃度的依賴性明顯轉(zhuǎn)向了更高的氧分壓值。此外，在神經(jīng)元活動(dòng)期間，葡萄糖可能無(wú)法完全滿足神經(jīng)元的能量需求，因此還需要其他與葡萄糖互補(bǔ)的能源物質(zhì)來(lái)為氧化代謝提供充分的支持。鑒于在眾多電生理學(xué)研究中，切片中的氧分壓以及腦灌注液中的能量物質(zhì)組成均未得到控制。

圖1、灌流速率對(duì)切片氧分壓和LFP幅度的影響。A）氧分壓深度分布，(a)：展示了在15ml/min和4ml/min灌流速率下，腦切片中的氧分壓深度分布。圖中灰色條表示切片的位置。在15ml/min時(shí)，切片核心的氧分壓約為300Torr，而4ml/min時(shí)，切片核心的氧分壓急劇下降。(b)在CA1區(qū)記錄的LFPs，由單次刺激Schaffer collateral（SC）引起。LFPs的幅度在15ml/min時(shí)顯著高于4ml/min。(c)統(tǒng)計(jì)總結(jié)了不同灌流速率下LFP積分值的變化。15ml/min時(shí)的LFP積分值顯著高于4ml/min。B）雙層灌流室中的氧分壓。C）阿登苷酸受體拮抗劑DPCPX對(duì)LFP的影響。

圖2、刺激協(xié)議中的局部場(chǎng)電位和氧分壓動(dòng)態(tài)。A.氧分壓和LFPs的同步記錄。展示了在15ml/min灌流速率下，通過(guò)一系列單次SC刺激（1/7s）激活神經(jīng)元后，30秒10Hz刺激引起的氧分壓和LFPs的動(dòng)態(tài)變化。B.氧分壓和LFPs的時(shí)間過(guò)程。展示了氧分壓和LFPs隨時(shí)間的變化過(guò)程，進(jìn)一步說(shuō)明了兩者之間的相關(guān)性。

圖3、不同灌流速率下的氧分壓、NAD(P)H信號(hào)和LFPs。A）氧分壓和NAD(P)H自熒光。展示了在15ml/min和4ml/min灌流速率下，氧分壓和NAD(P)H自熒光的變化。B）LFPs在刺激訓(xùn)練中的變化。展示了在不同灌流速率下，LFPs在30秒10Hz刺激訓(xùn)練中的變化。C）LFPs積分值的比較。展示了不同灌流速率下，LFPs積分值的變化。在4ml/min時(shí)，LFPs積分值顯著下降。

圖4、4-AP誘導(dǎo)的同步網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)對(duì)灌流速率的依賴性。展示了在不同灌流速率下，4-AP誘導(dǎo)的同步網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的LFPs和氧分壓的變化。

圖5、在充足氧氣供應(yīng)下，富含能量底物的ACSF增強(qiáng)氧化代謝和突觸功能。A）氧分壓和NAD(P)H瞬態(tài)以及LFPs，展示了在富含能量底物的ACSF（eACSF）中，30秒10Hz刺激引起的氧分壓和NAD(P)H自熒光的變化，以及LFPs的動(dòng)態(tài)變化。B）LFPs積分值，展示了在eACSF中，LFPs積分值的變化。在eACSF中，LFPs的幅度顯著增加。C）氧分壓和NAD(P)H信號(hào)參數(shù)。展示了在eACSF中，氧分壓和NAD(P)H信號(hào)參數(shù)的變化。

結(jié)論與展望

大腦中的血管-神經(jīng)-神經(jīng)膠質(zhì)相互作用系統(tǒng)能夠控制大腦的能量供應(yīng)，而在培養(yǎng)皿中這一系統(tǒng)是不存在的，因?yàn)槟芰抗?yīng)是由實(shí)驗(yàn)條件決定的。盡管神經(jīng)元活動(dòng)極其耗能，但關(guān)于浸沒(méi)腦切片中的能量代謝狀態(tài)卻鮮有報(bào)道。由于缺乏這些信息，隨意選擇的氧合和代謝條件使得在切片中的有效氧化代謝變得不可靠。研究表明，在小鼠海馬切片（出生后第19-44天）中，誘發(fā)的神經(jīng)元放電、自發(fā)的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)（由4-氨基吡啶引發(fā)）以及突觸刺激誘導(dǎo)的NAD(P)H胞質(zhì)熒光強(qiáng)烈依賴于氧氣供應(yīng)情況。只有當(dāng)灌注速率高達(dá)約15毫升/分鐘（95%氧氣）時(shí)，才能為切片提供適當(dāng)?shù)难鯕夤?yīng)。較低的氧合會(huì)導(dǎo)致局部場(chǎng)電位和自發(fā)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的減少，以及短期突觸可塑性的顯著調(diào)節(jié)。氧氣供應(yīng)的減少顯著抑制了NAD(P)H信號(hào)的氧化階段，表明神經(jīng)元活動(dòng)的變化與有氧能量代謝的減少是平行的。與體內(nèi)條件相比，神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)氧張力的依賴性在切片中明顯向更高的氧濃度方向轉(zhuǎn)移。高灌注率提供的充足的氧氣量、將腦灌注液中的葡萄糖部分替換為β-羥基丁酸、丙酮酸或乳酸，都能增強(qiáng)氧化代謝和突觸功能。這表明大腦中高氧含量是維持氧化代謝的必要條件，而僅靠葡萄糖無(wú)法滿足神經(jīng)活動(dòng)期間的能量需求。研究結(jié)果表明，能量代謝決定了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能狀態(tài)，這突顯了在體外實(shí)驗(yàn)中必須確保提供充足的代謝支持。