能量應(yīng)激反應(yīng)途徑。

為了測試SDS細胞利用哪些代償機制來抵消能量生產(chǎn)缺陷(能量應(yīng)激)，我們評估了AMP激活蛋白激酶(AMPK)和PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶標(mTOR)通路，它們是能量缺乏激活的主要調(diào)節(jié)機制。

在應(yīng)激條件下，AMPK通過AMP積累被激活，拮抗mTOR并刺激糖酵解等替代性分解代謝過程，從而抵消能量限制。PI3K/AKT/mTOR通路通過線粒體和核糖體的生物生成誘導(dǎo)細胞增殖。被PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)在Thr803處磷酸化的AKT會抑制AMPK并誘導(dǎo)mTOR激活。因此，在野生型細胞中，當AMPK被激活時，PI3K/AKT/mTOR通路通常會受到抑制。

如預(yù)期的那樣，在SDS細胞中，AMPK比對照組更活躍，如蛋白磷酸化形式的Western印跡分析所示(圖3)。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組和校正對照組相比，mTOR并未受到抑制，反而高度磷酸化。

與這一發(fā)現(xiàn)相一致的是，我們發(fā)現(xiàn)與野生型細胞和校正細胞相比，SDS細胞中AKT在Thr803和Ser473處也過度磷酸化，從而證實了整個PI3K/AKT/mTOR通路的過度激活。

總之，這些實驗表明，SDS細胞對高能應(yīng)激反應(yīng)異常，而這種反應(yīng)與SDS蛋白有關(guān)，因為在校正細胞中未見PI3K/AKT/mTOR通路超活化。

SDS細胞的細胞質(zhì)鈣濃度水平很高。

Ca2+調(diào)節(jié)真核蛋白質(zhì)翻譯和許多其他消耗ATP的細胞反應(yīng)，因此是蛋白質(zhì)合成和能量代謝的重要信號分子。此外，高[Ca2+]i與ROS細胞毒性、脂質(zhì)過氧化和OXPHOS功能密切相關(guān)，并且會抑制復(fù)合體IV的活性。

在靜息狀態(tài)下，SDS細胞的[Ca2+]i比野生型細胞(65±2nM)或校正細胞(64±1nM)高出兩倍(133±8nM)(表1)。

為了研究[Ca2+]i增高的原因，我們評估了ER從細胞質(zhì)中捕獲并儲存鈣的能力。事實上，ER是細胞內(nèi)主要的鈣儲存場所，并通過SERCA(鈣ATP酶通道)活性在Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，SERCA可將Ca2+從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到ER。硫代碳酸氫鹽(TG)不可逆地阻斷SERCA通道，導(dǎo)致Ca2+從ER泄漏，從而增加[Ca2+]i。與SDS細胞相比，高劑量TG處理(3μM)會導(dǎo)致野生型細胞和校正細胞中的[Ca2+]i顯著增加，從而表明這些細胞在ER中儲存Ca2+的能力受損，這可能是[Ca2+]i增加的原因(表1)。

盡管我們沒有發(fā)現(xiàn)任何SERCA通道活性差異，但我們推測[Ca2+]i的增加可能取決于我們在SDS細胞中觀察到的mTOR激活，已知mTOR可通過肌醇-1,4,5三磷酸受體正向調(diào)節(jié)鈣釋放。

亮氨酸可恢復(fù)正常代謝表型。

由于亮氨酸(Leucine，Leu)是一種已知能促進蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸，即使在SBDS缺乏的細胞中也是如此，因此我們測試了亮氨酸在處理5天后對SDS淋巴細胞和淋巴母細胞的生化影響。經(jīng)過Leu處理后，復(fù)合體IV的功能得到恢復(fù)，呼吸速率和ATP/AMP比率與對照組相當(圖4A-D)，細胞內(nèi)鈣濃度也有所降低(圖4G)。表型逆轉(zhuǎn)還與脂質(zhì)過氧化和乳酸產(chǎn)生的減少有關(guān)(圖4E、F)。令人驚訝的是，用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(一種抗氧化分子，是還原型谷胱甘肽的前體)處理后，在SDS細胞中觀察到的呼吸缺陷、能量窘迫和鈣平衡改變沒有恢復(fù)或恢復(fù)較差。

然后，我們測試了Leu對SDS患者骨髓造血干細胞生長的影響，觀察到紅細胞集落生長適度增加，但髓系細胞集落生長沒有增加(圖5A)。由于Leu是mTOR激活的調(diào)節(jié)劑，我們研究了它在慢性SDS細胞處理后對能量應(yīng)激途徑的影響。不出所料，AMPK磷酸化的減少是正常OXPHOS恢復(fù)的結(jié)果。有趣的是，Leu處理后AKT和mTOR磷酸化水平也降低了(圖5B)。可以推測這些影響是由于依賴于營養(yǎng)過剩的AKT/mTOR通路的反饋調(diào)節(jié)所致。說明Leu恢復(fù)了SDS細胞的生化表型，該分子可被視為恢復(fù)SDS細胞能量代謝的潛在工具。

討論

SBDS蛋白在核糖體生物生成和蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮作用，而這兩個高耗能過程與細胞能量的產(chǎn)生密切相關(guān)。細胞呼吸是將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生化能量(主要是ATP)的一系列代謝反應(yīng)和過程。這一過程由一系列稱為電子傳遞鏈的蛋白質(zhì)復(fù)合物完成，電子傳遞鏈位于線粒體內(nèi)膜，并與線粒體膜間隙和基質(zhì)相連。呼吸功能受損會影響ATP的產(chǎn)生，并使細胞面臨能量和氧化壓力。

在本研究中，我們評估了SDS細胞的能量代謝，發(fā)現(xiàn)在丙酮酸/蘋果酸或琥珀酸的誘導(dǎo)下，氧消耗會受損。因此，ATP生成減少，AMP積累，從而改變了ATP/AMP比率。

電子通過兩條途徑傳輸。第一種由復(fù)合物I、III和IV組成，從NADH中轉(zhuǎn)移電子，可由丙酮酸/蘋果酸誘導(dǎo)。另一種需要復(fù)合體II、III和IV，由琥珀酸激活，從FADH2中轉(zhuǎn)移電子，能量產(chǎn)生效率低于第一種途徑。由于丙酮酸/蘋果酸和琥珀酸在SDS細胞中對耗氧量的影響程度相同，我們對兩種途徑共有的兩個復(fù)合物(III和IV)的活性進行了研究，結(jié)果表明復(fù)合物IV不能正常工作。

復(fù)合體IV活性受損的原因尚不清楚。我們評估了分別由核基因和線粒體基因編碼的復(fù)合體IV的兩個亞基COX5A和COX2的表達水平，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白的表達水平正常。這表明，盡管SDS細胞中存在核糖體生物發(fā)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷，但它們的合成并沒有受損。不過，值得注意的是，復(fù)合體IV由32個蛋白質(zhì)組成，其中3個由線粒體DNA編碼，29個由核DNA編碼。此外，其中11個是結(jié)構(gòu)蛋白，18個是組裝因子；因此，我們不能排除其他亞基表達較少或折疊不正確的可能性。

另一個原因可能是線粒體膜發(fā)生了變化，這是由復(fù)合體III和IV之間或復(fù)合體IV與氧之間的電子傳遞發(fā)生變化所決定的，從而導(dǎo)致細胞色素c氧化酶活性受損，氧化應(yīng)激增加。然而，這種可能性似乎不大，因為我們在SDS細胞中測得的氧化應(yīng)激水平較低，并觀察到線粒體膜明顯完整。

值得注意的是，盡管復(fù)合體IV在ROS生成中起間接作用，但復(fù)合體IV的損傷可能是由復(fù)合體I和復(fù)合體III的上游電子累積引起的，從而導(dǎo)致ROS生成增加。事實上，線粒體電子傳遞鏈包含多個氧化還原中心，可直接將電子傳遞給氧氣，從而產(chǎn)生ROS。不過，也可能有其他結(jié)構(gòu)參與了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)。特別是，由于SDS細胞的特點是蛋白質(zhì)生物生成缺陷，缺陷蛋白質(zhì)的積累可能會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白反應(yīng)。

復(fù)合體IV受損的另一個可能原因與所報道的SDS細胞中鈣水平的改變有關(guān)。細胞內(nèi)的鈣平衡在調(diào)控生化通路中發(fā)揮著重要作用，而生化通路可調(diào)節(jié)對高能應(yīng)激的反應(yīng)。特別是，Ca2+對能量代謝有雙重影響。一種作用是，[Ca2+]i可增強OXPHOS，從而激活克雷布斯循環(huán)脫氫酶和線粒體底物轉(zhuǎn)運體。另一個作用是，[Ca2+]i可能通過競爭復(fù)合體IV的陽離子結(jié)合位點而影響其活性。

考慮到這些數(shù)據(jù)(圖6)，在SDS細胞中觀察到的高[Ca2+]i可能與解釋SDS細胞的生化表型有關(guān)。SBDS與類延伸因子1(EFL1)合作，使eIF6從前60S核糖體亞基中釋放，從而形成核糖體80S。因此，在SDS細胞中，60S亞基的成熟是有缺陷的，其與40S亞基的結(jié)合也受到損害。此外，即使在細胞質(zhì)中，eIF6與前60S亞基的結(jié)合也會持續(xù)存在，阻止其循環(huán)到核仁。考慮到eIF6的核導(dǎo)入受細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)，我們可以推測，SDS細胞中細胞質(zhì)鈣濃度的增加試圖平衡核糖體生物發(fā)生的缺陷。

能量應(yīng)激會誘導(dǎo)細胞新陳代謝發(fā)生變化，從而刺激或抑制參與能量平衡調(diào)節(jié)的分子網(wǎng)絡(luò)，如AMPK和mTOR。在觀察到的SDS細胞中，由于能量應(yīng)激，AMPK被過度激活，糖酵解途徑受到刺激。令人驚訝的是，我們還發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR通路被異常地過度激活，因為這兩種蛋白都被過度磷酸化。我們推測，mTOR過度激活是SDS細胞支持能量缺陷和蛋白質(zhì)合成的一種方式，目的是改善OXPHOS活性。然而，用mTOR拮抗劑雷帕霉素處理SDS細胞可完全抑制殘余的OXPHOS活性，從而減少ROS的產(chǎn)生，進而通過糖酵解恢復(fù)能量。這表明，在SDS細胞生化改變的過程中，OXPHOS活性的增加在保證ATP產(chǎn)量增加的同時，也可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增強和細胞損傷的潛在增加(圖6)。在AMPK激活的情況下，mTOR激活的另一個潛在機制可能與自噬激活有關(guān)。在核糖體病中，氧化應(yīng)激的增加會通過mTOR-S6激酶途徑誘導(dǎo)自噬。考慮到本手稿中報告的數(shù)據(jù)，我們可以假設(shè)AMPK活性增強可能與細胞能量狀態(tài)受損有關(guān)，而mTOR通路激活可能與氧化應(yīng)激產(chǎn)生水平較高有關(guān)。

此外，mTOR還控制著幾個依賴Ca2+的過程。例如，它正向調(diào)節(jié)IP3R(三磷酸肌醇受體)介導(dǎo)的Ca2+釋放，并與Akt共同參與調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAM)的完整性、鈣通量和能量代謝。

最后，糖酵解代謝的增加會引起乳酸的積累和細胞內(nèi)pH值的降低，從而導(dǎo)致鈣泵受到抑制，細胞膜[Ca2+]隨之增加(圖6)。

亮氨酸是一種必需氨基酸，能促進細胞增殖和蛋白質(zhì)合成。核糖體病或其他核糖體生物發(fā)生缺陷的病癥可從這種氨基酸的治療中獲益。與這些研究一致，我們發(fā)現(xiàn)亮氨酸能改善SDS患者的體外紅細胞生成。此外，用亮氨酸處理SDS細胞可恢復(fù)OXPHOS和ATP合成，降低細胞質(zhì)鈣濃度以及AMPK和AKT/mTOR活性，這表明亮氨酸可能有助于維持SDS患者紊亂的能量代謝和紅細胞生成。特別是，考慮到亮氨酸能提高OXPHOS活性，部分恢復(fù)呼吸作用，因此它可能是AMPK和AKT/mTOR通路的調(diào)節(jié)劑，能恢復(fù)它們的生理作用。我們可以推測，亮氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激減少會導(dǎo)致mTOR-S6激酶途徑失活。

最后，值得注意的是，能量代謝是維持自我更新干細胞的決定因素。骨髓中的造血干細胞被封閉在缺氧的微環(huán)境中。缺氧條件使造血干細胞處于靜止狀態(tài)，這與糖酵解代謝有關(guān)。在(不對稱)自我更新干細胞分裂過程中，一個細胞保持干細胞的糖代謝特征，而另一個細胞則進入血管，獲得OXPHOS代謝并進行分化。造血干細胞對氧化應(yīng)激增加很敏感，而線粒體氧化磷酸化是產(chǎn)生ROS的主要原因。因此，糖酵解代謝是造血干細胞自我更新維持的決定因素。為了減少線粒體代謝，造血干細胞會積極調(diào)節(jié)AMPK，同時抑制PI3K/mTOR通路。AKT或mTOR信號的持續(xù)活躍和高[Ca2+]i水平會導(dǎo)致增殖增加和造血干細胞貧化。因此，這項研究可為了解導(dǎo)致SDS患者骨髓衰竭的生化途徑提供一個新的視角。

總之，我們首次發(fā)現(xiàn)，盡管SDS細胞的線粒體形態(tài)沒有發(fā)生顯著變化，但它卻遭受著與SBSD蛋白缺陷有關(guān)的能量應(yīng)激和嚴重的呼吸缺陷。這些缺陷可通過增強的AMPK、糖酵解和mTOR/Akt通路激活得到部分補償。在維持這種改變的新陳代謝中起關(guān)鍵作用的可能是鈣平衡的改變。