結(jié)果與討論

球體內(nèi)缺氧特征

球形體是一種體外腫瘤模型，與體內(nèi)腫瘤有一些共同特征，如增殖和營(yíng)養(yǎng)梯度、慢性缺氧和壞死。以前曾分別用HIF-1a免疫熒光法和PI染色法觀察過直徑為>400μm的球體(又稱"缺氧球體"或"缺氧3D球體")的缺氧區(qū)域和壞死核心。獲得的圖像顯示球核內(nèi)有大量壞死，并顯示輕度缺氧區(qū)域從球表面下30毫米的深度開始。然而，直徑為200微米以下的球體沒有缺氧或壞死的跡象，因此被稱為"非缺氧球體或非缺氧3D"。

現(xiàn)在繼續(xù)對(duì)活體球體內(nèi)的缺氧環(huán)境進(jìn)行表征。為此，采用侵入式微電極技術(shù)測(cè)量了大于400μm大球體內(nèi)的氧氣分布。其他作者發(fā)表的用微電極測(cè)量活體球體內(nèi)氧分壓的嘗試遇到了一些技術(shù)問題，并提出了需要批判性討論的問題。例如，Mueller-Klieser等人報(bào)告的穩(wěn)態(tài)測(cè)量每步耗時(shí)1分鐘，每個(gè)球體的總測(cè)量時(shí)間為20分鐘。在這段時(shí)間內(nèi)，被動(dòng)擴(kuò)散很可能會(huì)影響數(shù)據(jù)。為了繞過這個(gè)問題，我們使用了新型技術(shù)設(shè)備，每步測(cè)量可在4秒內(nèi)完成，每個(gè)球面的總測(cè)量時(shí)間約為1.5分鐘。

圖2、通過瓊脂糖包埋的HT1080和CH1/PA-1多細(xì)胞球體(直徑>400μm)與遠(yuǎn)離球體的瓊脂糖培養(yǎng)基的物理化學(xué)梯度比較，由微電極測(cè)量并以代表性樣本為例。(A)氧分布(以20μm為間隔測(cè)量)，(B)pH值(以40μm為間隔測(cè)量)，(C)氧化還原電位(以40μm為間隔測(cè)量)。剖面深度是相對(duì)于瓊脂糖表面而言的，因此球體相對(duì)于瓊脂糖表面的位置各不相同。

如HT1080和CH1/PA-1球形細(xì)胞所示(圖2A和ESI?)，我們的研究結(jié)果表明，氧梯度向球形細(xì)胞壞死核心移動(dòng)，球形細(xì)胞中心的氧分壓最低。這些結(jié)果與其他作者發(fā)表的數(shù)據(jù)非常吻合。對(duì)所有調(diào)查的細(xì)胞系和樣本(每個(gè)細(xì)胞系至少9個(gè)樣本)都監(jiān)測(cè)到了相似的模式；但觀察到絕對(duì)值因細(xì)胞系而異，因此也因球形體的緊密度而異，而且同一細(xì)胞系的球形體之間也存在個(gè)體差異。圖2顯示了HT1080和CH1/PA-1球形細(xì)胞的示例結(jié)果。實(shí)驗(yàn)裝置要求固定樣本并保持濕度和溫度；為此，樣本被嵌入瓊脂糖中。球體周圍的氧含量已明顯下降，但不含球體的瓊脂糖剖面測(cè)量結(jié)果(此處用作陰性對(duì)照)卻沒有出現(xiàn)這種情況，該結(jié)果僅顯示瓊脂糖深層的氧含量下降非常緩慢。

缺氧通常伴隨著pH值的顯著下降(酸中毒)，這在實(shí)體瘤和多細(xì)胞球體內(nèi)經(jīng)常可以觀察到。由于pH值是影響大多數(shù)化療藥物穩(wěn)定性的一個(gè)主要因素，我們采用微電極法研究了樣本中是否存在pH值梯度以及在多大程度上可以測(cè)量到這種梯度。結(jié)果表明，pH梯度沿氧分布模式向球形中心延伸，但幾乎沒有向球形周圍延伸(圖2B和ESI?)。觀察到的球形體表面與球形體中心之間的pH值差約為0.2個(gè)pH單位，這與其他作者之前發(fā)表的結(jié)果非常吻合。pH值曲線可大致反映出球形體的尺寸(>400μm)，而氧氣梯度更平坦，且更多地延伸到周圍的瓊脂糖中，這很可能是由于有活力的球形體持續(xù)消耗氧氣后產(chǎn)生的擴(kuò)散作用。

此外，據(jù)報(bào)道，缺氧會(huì)導(dǎo)致單層生長(zhǎng)的癌細(xì)胞的還原電位顯著下降。雖然預(yù)計(jì)球核中的大量缺氧也會(huì)導(dǎo)致還原電位顯著下降，但迄今為止還沒有相關(guān)測(cè)量報(bào)告。為了評(píng)估所使用的球粒模型中的氧化還原電位，我們在活體球粒中進(jìn)行了微電極測(cè)量。我們的數(shù)據(jù)顯示，氧化還原電位向球體中心顯著下降，這與氧氣和pH值的分布模式相似(圖2C和ESI?)。遺憾的是，實(shí)驗(yàn)裝置無(wú)法區(qū)分細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外區(qū)域。總體而言，氧含量、pH值和還原電位的降低強(qiáng)調(diào)了球體內(nèi)還原環(huán)境的存在，其中以壞死核心最為明顯(圖2和ESI?)。

抗增殖活性

研究癌癥細(xì)胞系的抗增殖活性是探索實(shí)驗(yàn)化合物抗癌潛力的關(guān)鍵第一步。因此，我們使用對(duì)鉑(II)類藥物敏感性不同的細(xì)胞系，包括CH1/PA-1卵巢畸胎癌(最敏感)、HCT116結(jié)腸癌(中度敏感)和HT1080纖維肉瘤(不敏感)細(xì)胞，在不同的缺氧和非缺氧細(xì)胞培養(yǎng)模型中研究了化合物1-4和沙鉑的細(xì)胞毒性，并將它們與奧沙利鉑(l-OHP)(之前發(fā)表的數(shù)據(jù))進(jìn)行了比較。第一步，通過阿拉瑪藍(lán)檢測(cè)法確定缺氧球形細(xì)胞和非缺氧單層培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值。在非缺氧單層培養(yǎng)物中，所有復(fù)合物對(duì)敏感細(xì)胞株CH1/PA-1的活性最高，IC50值大多在低微摩爾范圍內(nèi)，而對(duì)耐藥細(xì)胞株HT1080的活性最低。一般來說，復(fù)合物在所有三種細(xì)胞系中的活性按以下順序增加：1<4<2<3<沙鉑<l-OHP，表明參考化合物沙鉑和奧沙利鉑在單層培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性最強(qiáng)。研究化合物1-3的順序與這些物質(zhì)的親脂性非常吻合，1的親脂性最小，3的親脂性最大。這些數(shù)據(jù)與之前公布的結(jié)果非常吻合。在CH1/PA-1細(xì)胞系中的數(shù)值與參考文獻(xiàn)38中公布的數(shù)值略有不同，這可能是由于使用了一種名為"CH1/PA-1"的藥物。38中的數(shù)值略有不同，這可能是由于使用了不同的試劑對(duì)有活力的細(xì)胞進(jìn)行染色(MTT與阿拉瑪藍(lán))。

在缺氧球體(3D)模型(直徑為>400μm的球體，HIF1a和PI染色陽(yáng)性)中，細(xì)胞毒性的程度因化合物而異。在CH1/PA-1球形模型中，化合物1-4的活性轉(zhuǎn)移到更低的IC50值，而沙鉑和奧沙利鉑則受到負(fù)面影響。這些結(jié)果突顯了細(xì)胞系CH1/PA-1的敏感性，因?yàn)樵诿舾行暂^低的細(xì)胞系HT1080和HCT116中，大多數(shù)IC50值都會(huì)升高，只有HT1080細(xì)胞中的1例外。在比較三維CH1/PA-1模型中獲得的結(jié)果和還原速度時(shí)，可以明顯看出，還原速度較慢的物質(zhì)1(系數(shù)6.8)的細(xì)胞毒性效力最大，而還原速度較快的物質(zhì)2和3(系數(shù)分別為1.6和1.7)在缺氧條件下只顯示出輕微的激活作用。雖然在敏感性較低的細(xì)胞系HT1080和HCT116中，所有細(xì)胞毒性效力都受到了負(fù)面影響，但各因子的下降順序相似：1(因子1.3和0.6)>2(因子0.7和0.3)>3(因子0.4和0.1)。

令人驚訝的是，鉑(II)物種(4)在CH1/PA-1球形模型中顯示出1.6倍的活化作用，而沙鉑和奧沙利鉑的細(xì)胞毒性則有所減弱。由于該化合物中的鉑已經(jīng)處于活性較高的氧化態(tài)+II，因此在CH1/PA-1模型中觀察到的復(fù)合物4的活化現(xiàn)象無(wú)法用還原來解釋。但值得注意的是，鉑(II)參比化合物奧沙利鉑(l-OHP)并沒有表現(xiàn)出類似的活化作用。奧沙利鉑和4之間最重要的結(jié)構(gòu)差異在于離去基團(tuán)：一個(gè)草酸螯合基團(tuán)，而不是兩個(gè)氯化物。在鉑(II)中心與DNA結(jié)合之前，這些初始配體必須通過水合作用釋放出來。因此，受這些配體影響的吸水速率可能是復(fù)合物4活化的一個(gè)可能原因。Knox等人之前發(fā)表的研究結(jié)果支持了這一假設(shè)，即順鉑的水解速度是奧沙利鉑的112倍。此外，pH值以及三維模型中的pH值梯度對(duì)鉑(II)的水解過程及隨后的DNA結(jié)合至關(guān)重要，因?yàn)橛袌?bào)道稱，當(dāng)pH值大于8時(shí)，水溶液會(huì)轉(zhuǎn)化為活性較低的羥基，而pH值小于8時(shí)，結(jié)合動(dòng)力學(xué)會(huì)增加。

表1、復(fù)合物1-4、沙鉑和奧沙利鉑(l-OHP)在缺氧球狀(三維)模型和非缺氧單層(二維)模型中的細(xì)胞毒性，通過阿拉瑪藍(lán)檢測(cè)法測(cè)定(暴露時(shí)間96小時(shí))。

由于奧沙利鉑作為鉑(II)參比化合物，在三維實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞毒性與二維實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞毒性相比，IC50值增加了10倍(表1)，因此我們假設(shè)，觀察到的鉑(IV)原藥細(xì)胞毒性活性的增加可能反映了它們被還原激活。為了支持這一觀點(diǎn)，我們選擇了化合物1(還原率和親脂性最低)和化合物2(還原率和親脂性居中)，它們是在所有研究細(xì)胞系的缺氧球形體中按活化順序排列的表現(xiàn)最好的化合物，因此我們選擇它們?cè)诜侨毖跚蛐误w、缺氧單層培養(yǎng)以及缺氧異種移植中進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表2、化合物1和2在缺氧與非缺氧球體以及缺氧與非缺氧單層培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性

出乎意料的是，單層培養(yǎng)中的缺氧不會(huì)引起敏感細(xì)胞株CH1/PA-1中化合物的活化，而在不太敏感的細(xì)胞株HT1080和HCT116中IC50值會(huì)增加，與缺氧球形培養(yǎng)中的IC50值相當(dāng)(圖3和表2)。這些結(jié)果凸顯了單層培養(yǎng)和球形培養(yǎng)中缺氧的區(qū)別，單層培養(yǎng)細(xì)胞得到適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，對(duì)缺氧表現(xiàn)出早期反應(yīng)，但沒有壞死或凋亡的跡象，也沒有其他pH分布和蛋白質(zhì)表達(dá)模式。

圖3、化合物1和2在缺氧與非缺氧球形細(xì)胞和缺氧與非缺氧單層細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。(A)1在CH1/PA-1細(xì)胞中的濃度效應(yīng)曲線。(B)2在HT1080細(xì)胞中的濃度效應(yīng)曲線。

在CH1/PA-1的非缺氧球形模型(直徑為約200毫米的球形體，HIF1a和PI染色陰性)中，1的IC50值介于單層培養(yǎng)和缺氧球形體中的IC50值之間(缺氧2D>非缺氧2D>非缺氧3D>缺氧3D)(圖3)。與單層培養(yǎng)相比，2在缺氧和非缺氧CH1/PA-1球體內(nèi)的IC50值相當(dāng)，表明這兩種化合物在兩種球體模型中都有活化作用(表2)。1和2在非缺氧HT1080球形細(xì)胞中的情況也是如此，后者的IC50值與缺氧球形模型中的IC50值相當(dāng)。然而，在HCT116細(xì)胞中，非缺氧球形細(xì)胞中的IC50值與單層培養(yǎng)中的IC50值相當(dāng)。總的來說，這些觀察結(jié)果與在低氧球形培養(yǎng)基中獲得的結(jié)果一致，再次表明與HCT116和HT1080細(xì)胞相比，CH1/PA-1細(xì)胞具有較高的敏感性，而且活化順序相似：1≥2。