3.結(jié)果與討論

選擇具有良好導電性和生物相容性的碳纖維作為基底制備功能化微電極（CFME）（圖1A）。通過原位電沉積在CFME表面形成致密金微片（記為AuS/CFME）（圖1B和C）。在0.01 mol·L?1H?SO?中，AuS/CFME的循環(huán)伏安（CV）曲線在約0.9 V（vs.Ag/AgCl）處出現(xiàn)還原峰（圖1D），可用于計算電荷消耗量。電極的電化學活性面積可通過以下公式估算：

A = Q/386

其中Q為消耗電荷，單位面積清潔金電極的Q值為386μC·cm?2。計算得AuS/GO的電化學活性面積為0.05 cm2，約為裸CFME幾何面積的7.8倍。在1.0 mmol·L?1K?[Fe(CN)?]中的CV曲線（圖2）顯示“S”形特征電流峰，表明其具有典型微電極特性。此外，AuS/CFME的極限擴散電流比裸CFME高2.4倍，這可能源于增大的電化學活性面積（圖2曲線b）。

先前研究表明，在生理條件下，硫醇配體可能被豐富的生物硫醇（如谷胱甘肽GSH）取代，導致檢測失真和分子在金表面吸附不穩(wěn)定。為解決該問題，近年來開發(fā)了Au-C≡C鍵合法以增強分子在電極表面組裝的穩(wěn)定性。因此，選擇在適配體3′末端修飾炔基，以高穩(wěn)定性固定于AuS/CFME。同時，在適配體5′末端修飾二茂鐵（Fc）作為電化學響應信號，間接反映K?濃度變化。為合理調(diào)節(jié)適配體電化學傳感器的響應范圍以適應腦內(nèi)應用，設計了三種不同鏈長的適配體并固定于金納米顆粒修飾的CFME。相應的修飾微電極分別記為SAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-3′-C≡C-H）、MAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H）和LAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H）。通過紅外光譜（圖3）追蹤適配體探針在AuS/CFME上的修飾情況。適配體中C-O鍵、C=O鍵和-OH的出現(xiàn)表明適配體已成功修飾于AuS/CFME。

接下來，采用高靈敏度的差分脈沖伏安法（DPV）追蹤修飾過程。如圖4所示，在aCSF溶液（pH 7.4）中，SAC修飾的AuS/CFME在0.22 V（vs.Ag/AgCl）處出現(xiàn)陽極峰，歸因于Fc氧化為Fc?。Fc/Fc?的陽極電流信號強烈依賴于鏈長，SAC電極電流響應最大（曲線a），但隨著適配體鏈長的增加，電流響應逐漸減小（曲線b和c）。這些結(jié)果表明，較長的適配體修飾鏈導致Fc/Fc?與電極表面距離增加，從而減弱電流響應。

隨后，在不同K?濃度溶液中獲取不同適配體電極的DPV曲線。如圖5所示，SAC電極的峰值電流密度（Jp）隨K?濃度增加而逐漸增大。MAC和LAC電極也觀察到類似的電流隨K?濃度增加的趨勢。然而，三種適配體微電極對K?濃度的線性響應范圍不同：SAC為0.3 nmol·L?1–100 nmol·L?1（圖4B），MAC為3.0 nmol·L?1–10μmol·L?1（圖4D），LAC為10μmol·L?1–10 mmol·L?1（圖4F）。這些結(jié)果表明，適配體電極的響應強烈依賴于K?濃度，增加適配體鏈長可合理調(diào)節(jié)電化學傳感器對更高濃度水平的靈敏度。由于腦細胞外K?基礎濃度約為2.6 mmol·L?1，最終優(yōu)化選擇LAC作為電化學傳感器用于活體腦內(nèi)K?檢測。

電化學傳感器的選擇性對于復雜腦環(huán)境中的體內(nèi)應用至關(guān)重要。我們針對實際腦系統(tǒng)中共存的各種物質(zhì)（包括金屬離子（Na?、Ca2?、Mg2?、Cu2?、Zn2?和Al3?）、生物物種（AA、DA和UA）及氨基酸（Cys、Gln、His和Arg））進行了LAC的選擇性和競爭性測試。結(jié)果表明，所有干擾物的響應均小于3.5%（圖6），證明適配體修飾微電極具有高選擇性。此外，還研究了電極的穩(wěn)定性。將兩種分別修飾炔基和巰基適配體的微電極浸入GSH溶液（5 mmol·L?1）中模擬活體腦環(huán)境（圖7A）。發(fā)現(xiàn)炔基修飾微電極在浸泡8 h后仍保持96.4%的靈敏度，而巰基修飾電極僅剩76.4%。結(jié)果表明炔基修飾法可有效抵抗其他富硫醇物質(zhì)的干擾。接下來，還在不含K?的人工腦脊液（aCSF）中測試了炔基修飾微電極LAC的時間穩(wěn)定性。結(jié)果表明，LAC在aCSF中連續(xù)浸泡12 h后仍保持96.3%的靈敏度，證明LAC電極具有高穩(wěn)定性（圖7）。

為驗證體內(nèi)檢測的可行性，使用優(yōu)化后的LAC記錄小鼠海馬區(qū)在缺氧10 min前后細胞外K?濃度的變化（圖8A）。發(fā)現(xiàn)隨著小鼠腦缺氧開始10 min，海馬區(qū)K?濃度從2.6 mmol·L?1升至8.7 mmol·L?1（圖8B和C）。這種變化可能源于缺氧環(huán)境下腦細胞去極化。為驗證LAC電極測試結(jié)果的可靠性，我們還采集了小鼠海馬區(qū)腦脊液樣本并使用血氣分析儀測試，發(fā)現(xiàn)LAC電極與血氣分析儀測得的K?濃度差異小于4%，證明所開發(fā)的LAC微電極具有高準確性。

4.結(jié)論

本研究設計并應用了線性范圍可控的適配體修飾微電極，用于活體腦中K?的實時檢測。設計了三種不同鏈長的K?適配體，其中3′末端炔基用于錨定適配體探針于電極表面，5′末端二茂鐵作為電化學響應信號反映K?變化。發(fā)現(xiàn)隨著適配體鏈長的增加，微電極對K?檢測的線性響應范圍逐漸向高濃度移動。具有最長修飾鏈的LAC在10μmol·L?1–10 mmol·L?1范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性響應，滿足實際活體腦檢測需求。最終，LAC成功應用于缺氧后小鼠腦內(nèi)K?的體內(nèi)檢測。所開發(fā)的合理調(diào)節(jié)適配體修飾傳感器響應范圍的策略，可能為拓寬適配體傳感器在不同測量系統(tǒng)（尤其是腦分析）中的應用開辟新途徑。