2.4心肌缺血再灌注模型

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的相關(guān)法律和機(jī)構(gòu)指南。該方案獲得了中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，使用10%氯胺酮（0.3 mL/kg體重）腹腔注射麻醉八周大的雌性Sprague?Dawley大鼠；根據(jù)需要額外給予劑量以維持麻醉。然后使用5-0絲線結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈誘導(dǎo)局部心肌缺血。通過(guò)心電圖S-T段抬高確認(rèn)缺血，缺血30分鐘后，通過(guò)尾靜脈注射MBs或H2-MBs。再灌注3或24小時(shí)后，重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。一些大鼠被隨機(jī)選擇注射伊文思藍(lán)染料以分析患有心肌梗死后的潛在受損區(qū)域。

2.5梗死大小的評(píng)估

為了評(píng)估梗死大小，收集心臟，切成5節(jié)，然后在37℃下用0.1%三苯基四唑氯化物（TTC）溶液培養(yǎng)20分鐘。切片照相和稱(chēng)重。非梗死的活體心肌染成紅色，而梗死組織保持未染色（白色），然后使用計(jì)算測(cè)圖法（ImagePro Plus版本6.1）進(jìn)行測(cè)量。梗死大小計(jì)算公式為[(A1×W1)+(A2×W2)+(A3×W3)+(A4×W4)+(A5×W5)]，其中A是切片的梗死區(qū)域，W是各個(gè)部分的重量。梗死大小以對(duì)照心臟和H2-MB處理心臟的總心臟重量的百分比表示，如先前描述的那樣。

2.6超聲心動(dòng)圖檢查

治療后兩天，經(jīng)過(guò)30分鐘的缺血和24小時(shí)的再灌注處理后，大鼠吸入1.5%異氟醚麻醉。動(dòng)物被固定在可定位平臺(tái)上，仰臥位，使用Vevo 2100系統(tǒng)和MS-250探頭進(jìn)行短軸超聲心動(dòng)圖檢查（掃描速度1000 Hz，頻率21 MHz）。LV尺寸和FS%和EF%是在副胸長(zhǎng)軸視圖中使用M模式獲得的，從尾緣到前緣。根據(jù)美國(guó)超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)指南計(jì)算超聲心動(dòng)圖變量。

2.7血紅素和伊紅（H&E）染色和免疫組化

大鼠在30分鐘的缺血和24小時(shí)的再灌注后，用七氟烷麻醉，然后解剖心臟，用4%緩沖福爾馬林在4℃固定24小時(shí)。然后，將心臟石蠟包埋并切成5μm厚的切片，將切片脫脂，并使用PBS重新水化，然后用H&E（H&E染色試劑盒，Sigma-Aldrich）染色。隨后，將切片在4℃過(guò)夜孵育，使用兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體（1:400稀釋?zhuān)籆ell Signaling），然后在PBS中三次洗滌后，將切片在室溫下與山羊抗兔IgG二抗（1:1000稀釋?zhuān)籄bcam）孵育30分鐘。免疫反應(yīng)信號(hào)使用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺可視化。然后，用蘇木精藍(lán)染色，并在顯微鏡下檢查（Q500MC；Leica圖像分析系統(tǒng)）。

2.8 TUNEL檢測(cè)

根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化將數(shù)字素標(biāo)記的dUTP嵌入DNA中，然后在盲目方式下計(jì)數(shù)染色的切片中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)量。

2.9 ELISA檢測(cè)

將心臟組織按照補(bǔ)充方法描述進(jìn)行均質(zhì)處理。然后，在上述方法制備的上清液中使用商業(yè)化試劑盒（eBioscience，明尼阿波利斯，MN）根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量TNF-α、IL-1β和8-OHdG水平。樣品的吸光度在450 nm波長(zhǎng)處用微板讀數(shù)器（多功能酶標(biāo)Synergy，BioTek）讀取，然后根據(jù)TNF-α、IL-1β和8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)曲線的光密度值計(jì)算濃度。使用卡巴亞酶-3比色法檢測(cè)卡巴亞酶-3活性，從中確定吸光度為405 nm，然后計(jì)算濃度。

2.10丙二醛（MDA）和MPO的測(cè)量

使用MDA和MPO試劑盒（南京建成生物研究所，中國(guó)）確定心肌組織中的MDA和MPO水平。簡(jiǎn)要地說(shuō)，使用上述方法制備組織勻漿，使用BCA蛋白定量法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)確定MDA（nmol/mg）和MPO水平（U/mg），并將其歸一化為總蛋白。

2.11心肌組織中ROS的定量

在30分鐘的缺血和40分鐘的再灌注后，動(dòng)物被安樂(lè)死，取出心臟，然后均勻地勻漿心臟樣本。然后，將勻漿物立即與10μM 5-（和-6）-氯甲基-2'，7'-二氯二氫熒光素乙酯乙酸酯（CM-H2DCFDA，由分子探針購(gòu)買(mǎi)）、5μM二氨基熒光素-2-乙酸酯（DAF-2DA，由大一純化學(xué)品公司購(gòu)買(mǎi)）或5μM硝基噻唑啉鹽（NBT）反應(yīng)30分鐘，以檢測(cè)細(xì)胞H2O2、NO?或O2??水平。然后，使用自動(dòng)微板讀數(shù)器（BioTek Synergy4）在510 nm處讀取CM-H2DCFDA和DAF-2DA的熒光信號(hào)，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。由于O2??將NBT還原為NBT二甲腙的吸光度在550 nm處檢測(cè)。我們使用0.4μM 3'-(p-羥基苯基)熒光素（HPF，由分子探針購(gòu)買(mǎi)）來(lái)檢測(cè)?OH，然后測(cè)量515 nm處的熒光信號(hào)，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。

2.12統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，并使用SPSS 13.0（芝加哥，IL）進(jìn)行分析。進(jìn)行單一比較的未配對(duì)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)和多組比較的方差分析（ANOVA）。P值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。

3結(jié)果

3.1 H2-MBs的表征

首先開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)以下步驟將H2裝載到MBs中的程序：薄膜形成/水合、瓶封、八氟丙烷（C3F8）置換、H2置換和振動(dòng)（圖1a）。比較了不同C3F8/H2比率（體積/體積）的MBs的特征差異，發(fā)現(xiàn)隨著H2添加量的增加，MBs的濃度減小。在沒(méi)有C3F8的情況下產(chǎn)生了少量的MBs（C3F8/H2=0:3）（圖S1），其MB產(chǎn)量約為其他組的約100倍（表S1）。通常，H2-MBs在顯微鏡下顯示出多分散和球形形態(tài)（圖S2）。在C3F8/H2比率為3:0和1:1時(shí)，MB的平均直徑、大小分布和MB穩(wěn)定性沒(méi)有顯著差異，而在缺乏C3F8時(shí)MB大小增加（圖S3和S4和表S1）。當(dāng)使用C3F8/H2比率為1:1時(shí)，H2-MBs中的H2含量為1.46±0.08和0.14±0.13μmol H2/mL MB懸浮液（表S1）。因此，所有后續(xù)的體外和體內(nèi)研究均使用了最佳配方（C3F8/H2比率為1:1）。

接下來(lái)，通過(guò)監(jiān)測(cè)H2水平的時(shí)間變化來(lái)分析H2釋放曲線，使用直接插入H2-MB懸液的針狀氫氣電極在PBS或大鼠LV腔中。結(jié)果顯示，在加入H2-MBs后，PBS中的H2水平開(kāi)始增加，并在2分鐘后達(dá)到最大水平（180±0.02μmol/L）（圖1b）。動(dòng)物體內(nèi)的H2釋放速率與PBS中觀察到的相似，最大值為119±0.02μmol/L，注射H2-MBs后2分鐘。相反，在體內(nèi)，H2濃度的衰減速率更快，在10分鐘后，H2水平為9.02±0.02μmol/L（圖1c）。在加入對(duì)照MBs（僅含純C3F8的載體）后，體內(nèi)和體外的H2水平均不發(fā)生變化。

圖1.H2-MBs的制備和表征。（a）H2-MBs制備的示意圖。將由DSPC和DSPE-PEG2000（摩爾比=90:10）組成的15毫克磷脂混合物溶解在氯仿中。在形成膜和水合后，將含水分散液（脂質(zhì)體）裝入4 mL瓶中（每瓶1 mL），并用八氟丙烷（C3F8）置換瓶中的空氣。隨后，顛倒瓶子，并用注射器注入一定量的H2。因此，瓶子中擠出相等體積的C3F8。震動(dòng)45秒后獲得H2-MBs。（b）從上述方法中獲得的H2-MBs的代表性圖像（C3F8/H2比為1:1）。（c、d）體內(nèi)外H2釋放的代表性時(shí)間曲線。

在體外實(shí)驗(yàn)中，將4×109 H2-MBs或?qū)φ誐Bs（載體）加入5 mL PBS中，并使用針式氫氣電極檢測(cè)來(lái)自MBs的H2釋放。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將2×1010 H2-MBs或?qū)φ誐Bs靜脈注射到大鼠體內(nèi)，并使用針式氫氣電極連續(xù)記錄血液中的H2濃度，該氫氣電極插入LV腔中（n=5）。箭頭表示添加H2-MBs或?qū)φ誐Bs的時(shí)間。