pHbrain測量

測量在自制的法拉第籠內(nèi)進行，采樣頻率為4 Hz。pH選擇性微電極（外尖端直徑：50μm）購自Unisense，而玻璃參比微電極（外尖端直徑：~20μm，填充150 mM NaCl；電阻：~4-5x101?Ohm）為自制，并與Ag/AgCl絲電極一起使用。在每次實驗前，將電極安裝在立體定位操縱器上，在3種不同的預(yù)熱（38°C）緩沖溶液（pH分別為：6.10,7.10,和8.10）中進行校準。將仔豬頭部固定在立體定位框架中，縮回頭皮后，在額頂葉皮層上方制作兩個小圓形顱骨開窗（直徑≥5 mm），輕輕去除硬腦膜。將pH和參比微電極的尖端安裝到暴露的皮層內(nèi)約1-2 mm深度，并將Ag/AgCl接地電極置于頭皮下方。使用定制構(gòu)建的差分靜電計（>101?Ohm輸入阻抗；16 Hz低通截止）、16位模數(shù)轉(zhuǎn)換器和WinEDR軟件，或使用Microsensor Multimeter和SensorTrace Logger軟件記錄、數(shù)字化和存儲電極信號。離線評估記錄：通過應(yīng)用線性回歸分析，將校準溶液中的信號與曲線擬合，并使用線性插值將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為pH值。由于該技術(shù)僅能可靠地穩(wěn)定連續(xù)測量pHbrain 3-4小時，因此在不同的動物中，選擇不同的時間窗口進行評估（基線、PA和復(fù)蘇前4小時（n=6）、復(fù)蘇第8-14小時（n=8）和第20-24小時（n=3），如結(jié)果中所示）。

誘導(dǎo)窒息

手術(shù)后，1小時的恢復(fù)期允許監(jiān)測的生理參數(shù)在獲取基線值之前穩(wěn)定下來。通過將通氣從醫(yī)用空氣轉(zhuǎn)換為低氧高碳酸血癥氣體混合物（6%O?,20%CO?,平衡N?）20分鐘來誘導(dǎo)PA，同時將呼吸頻率降低至15次/分鐘，并停止液體/葡萄糖輸注。仔豬（n=13）用醫(yī)用空氣進行復(fù)蘇（呼吸頻率：30次/分鐘），持續(xù)實驗的剩余時間。

在另外三只動物中，在誘導(dǎo)PA之前，通過將吸入CO?從0%逐步增加至20%（每步5%，每次持續(xù)7-8分鐘）來評估分級正常氧高碳酸血癥對pHbrain的影響。分級高碳酸血癥后，恢復(fù)正常碳酸血癥30分鐘。這些動物在PA后2小時用過量戊巴比妥鈉（300 mg）實施安樂死。

神經(jīng)病理學(xué)

神經(jīng)病理學(xué)檢查的目的是測試窒息誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是否與我們之前使用該PA/HIE模型在窒息后24小時報告的結(jié)果相似。因此，在暴露于PA的13只仔豬中，僅包括那些維持24小時的動物（n=8）。在窒息結(jié)束24小時后，通過導(dǎo)管插入的頸總動脈用冷（4°C）生理鹽水灌注八只麻醉動物的腦組織。輕輕取出腦組織，并在進一步處理前浸入4°C的4%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋的4μm切片用蘇木精-伊紅染色，并通過光學(xué)顯微鏡評估進行神經(jīng)病理學(xué)評估。使用暗嗜酸性胞漿以及核固縮或核破裂的主要特征來識別受損神經(jīng)元。在前額葉、頂葉、顳葉和枕葉皮層中，采用先前公布的評分系統(tǒng)測定腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的程度。簡言之，在每個評估的皮質(zhì)區(qū)域中，在20倍放大倍數(shù)下檢查20個不重疊的視野，確定神經(jīng)元損傷的模式（無<分散<成群<全層）。然后，根據(jù)觀察到的最嚴重損傷模式的頻率（占20個檢查視野的百分比）對每個區(qū)域進行評分（0-9分）。按照[11,21]中的方法，通過在不重疊區(qū)域（分別在5-5-3個視野中；200倍放大倍數(shù)下）進行細胞計數(shù)來評估殼核、丘腦和海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷。這些區(qū)域的神經(jīng)元損傷以受損神經(jīng)元的百分比表示。

統(tǒng)計分析

使用SigmaPlot（v12.0）或MATLAB環(huán)境離線分析結(jié)果并繪圖。神經(jīng)病理學(xué)評分表示為中位數(shù)、25-75百分位數(shù)和5-95百分位數(shù)。所有其他數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。使用Shapiro-Wilk檢驗正態(tài)性。使用MATLAB的多項式曲線擬合計算PaCO?和pHbrain數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。參數(shù)數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測量方差分析（RM ANOVA）進行比較，隨后進行Student-Newman-Keuls事后檢驗。顯著性水平（p）設(shè)定為0.05。

結(jié)果

PA期間和HIE發(fā)展過程中的pHbrain變化

誘導(dǎo)PA引起pHbrain降低，在20分鐘的損傷期間持續(xù)下降而未達到穩(wěn)定，期間pHbrain從基線值7.21±0.03下降至窒息結(jié)束時的5.94±0.11（n=6；圖1A）。復(fù)蘇后，pHbrain在29.4±5.5分鐘內(nèi)恢復(fù)至7.0，隨后穩(wěn)定在幾乎與原始基線無法區(qū)分的水平。此后，從2小時起，pHbrain保持在略低于基線的水平（平均低0.10±0.02 pH單位），在24小時隨訪期內(nèi)任何觀察時間點均未顯示明顯改變（圖1B）。

在20分鐘PA期間，氧飽和度降至30%以下，HR在最初2分鐘內(nèi)從約140次/分鐘增加至近200次/分鐘，之后未顯示重大變化，而MABP的反應(yīng)是雙相的，先短暫升高至約90 mmHg，隨后緩慢下降至基線以下（圖2）。在復(fù)蘇的最初2-3分鐘內(nèi)，氧飽和度迅速恢復(fù)至80%以上，同時HR和MABP短暫升高至240次/分鐘和80 mmHg以上，之后信號逐漸恢復(fù)正常。

長期監(jiān)測生理參數(shù)很好地反映了PA和復(fù)蘇的預(yù)期效果。血液血紅蛋白濃度（基線：8.0±0.3 g/dl；時間進程未圖示）、核心體溫（通過加熱控制，見方法）、氧飽和度、MABP和HR在PA前的基線處于正常范圍內(nèi)，并且在整個存活期間的值與基線無顯著差異。

除脈搏血氧測定數(shù)據(jù)外，PA結(jié)束時的動脈血氣分析也證實了中心血紅蛋白去飽和的發(fā)展（從94±4%降至13±4%），并伴有嚴重酸中毒、低氧血癥和高碳酸血癥。

實際上，動脈血pH（pHa）從7.53±0.03下降至6.79±0.02是顯著的，并伴隨著PaCO?升高至160±6 mmHg，然而，pHa仍比pHbrain高0.8個pH單位以上。血糖和乳酸水平也顯著升高，表明了對PA的代謝反應(yīng)。堿剩余大幅下降17.4±1.5 mmol/L和碳酸氫鹽濃度降低，連同PA結(jié)束時低的pHa（6.79）表明，窒息發(fā)展程度遠超人類新生兒嚴重BA的關(guān)鍵臨床標準（pH&lt;7.0且堿缺失≥12至16 mmol/L）。復(fù)蘇迅速恢復(fù)了動脈血中的正常氧合狀態(tài)，但PaCO?水平仍略有升高，盡管該變化僅在4小時時有統(tǒng)計學(xué)意義。此時堿剩余已恢復(fù)正常，pHa恢復(fù)至7.39±0.02，這對仔豬而言是正常值。以類似的方式，血糖和乳酸水平也在4小時時恢復(fù)至基線，盡管兩者在PA后1小時時仍顯著升高。

神經(jīng)病理學(xué)分析通過在所有檢查的新皮質(zhì)區(qū)域（圖4A和4C）以及海馬CA1區(qū)、丘腦和殼核（圖4B）顯示中度/重度神經(jīng)元損傷，證實了HIE的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)與之前使用相同PA應(yīng)激報告的神經(jīng)元損傷一致。