2.17.S-硫水合蛋白的測定

采用兩種方法檢測S-硫水合蛋白。為鑒定潛在的S-硫水合蛋白，按照先前描述的方法進(jìn)行馬來酰亞胺測定。紅細(xì)胞在4°C下以250 mM HEPES-NaOH（pH 7.7）、1 mM EDTA和0.1 mM新亞甲藍(lán)組成的RIPA-A緩沖液中裂解30分鐘。裂解液以20,000×g離心10分鐘。收集上清液，然后在4°C下與2 mM Alexa Fluor 680標(biāo)記的C2馬來酰亞胺孵育2小時(shí)，期間偶爾輕輕混合，隨后在4°C下與或不與1 mM DTT孵育1小時(shí)。裂解液用于SDS-PAGE凝膠電泳。從凝膠中收集具有S-硫水合的蛋白條帶，通過LC-MS/MS分析以鑒定可能的S-硫水合蛋白。為測定Hb和BPGM的S-硫水合，按照先前描述的方法進(jìn)行生物素交換測定。紅細(xì)胞在HEN緩沖液中均質(zhì)化，該緩沖液由250 mM HEPES-NaOH（pH 7.7）、1 mM EDTA和0.1 mM新亞甲藍(lán)組成，并補(bǔ)充了100μM去鐵胺。在4℃條件下以13,000×g離心30分鐘后，將上清液與HEN緩沖液（含2.5%SDS和20 mM甲硫基甲磺酸甲酯）于50℃孵育20分鐘，期間頻繁渦旋。隨后加入丙酮去除甲硫基甲磺酸甲酯，混合液在-20℃下靜置20分鐘使其沉淀。離心后，將蛋白質(zhì)重懸于含1%SDS的HEN緩沖液（即HEN-S緩沖液）。向懸浮液中加入不含抗壞血酸的二甲基亞砜配制的生物素-HPDP溶液，于2℃條件下孵育3小時(shí)。

圖1：硫化氫水平降低導(dǎo)致Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG生成增加和Hb-O2親和力下降。野生型和Cse-/-小鼠分別給予生理鹽水或GYY4137（133μmol/kg）。（a–c）注射24小時(shí)后分離紅細(xì)胞以測定2,3-BPG水平(a)和氧解離曲線（(b)P50值；(c)氧解離曲線的代表性跡線）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=10）。***p<0.001，*****p<0.0001。

2.18統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20軟件完成。數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過Shapiro-Wilk檢驗(yàn)評估數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況。統(tǒng)計(jì)顯著性判定依據(jù)樣本分布及方差齊性。兩組間統(tǒng)計(jì)比較采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正。使用條款詳見Wiley在線圖書館的條款與條件；開放獲取文章受適用的知識共享許可協(xié)議約束。多組分析采用事后檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)合Dunn事后檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)為p<0.05。

3結(jié)果

3.1 Cse?/?小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG水平降低且Hb氧親和力增加

我們使用Cse-/-小鼠探索了硫化氫在紅細(xì)胞中的功能作用，因?yàn)镃se-/-小鼠顯示出顯著降低的硫化氫水平。通過代謝組學(xué)技術(shù)，我們在紅細(xì)胞中鑒定出98種代謝物，并發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，Cse-/-小鼠的多個(gè)代謝途徑（如丙酮酸代謝、糖酵解或糖異生）發(fā)生了顯著變化。值得注意的是，與野生型小鼠相比，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中的代謝物中2,3-BPG顯著升高。隨后通過分光光度法測定證實(shí)了Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG水平的升高（圖1(a)）。由于2,3-BPG是一種特異性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)Hb-O2親和力，我們檢測了Cse-/-小鼠的氧解離曲線。如預(yù)期，與野生型小鼠相比，Cse-/-小鼠的50%氧飽和度（P50）值顯著升高了4至6 mmHg（圖1(b)和1(c)）。為確保Cse-/-小鼠中2,3-BPG和P50水平的升高是由于硫化氫生成減少所致，我們用緩釋硫化氫供體GYY4137處理了Cse-/-小鼠。如圖1(a)–1(c)所示，GYY4137（133μmol/kg）處理導(dǎo)致2,3-BPG和P50水平降低。

值得注意的是，GYY4137本身降低了野生型小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG和P50水平。由于pH是Hb-O2親和力和2,3-BPG形成的主要決定因素之一，我們還檢測了紅細(xì)胞中的pH值。在野生型（WT）與Cse-/-小鼠之間未發(fā)現(xiàn)pH的顯著差異，這表明Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG和P50水平的升高與pH無關(guān)。已知CSE在組織中廣泛表達(dá)。一些研究表明CSE活性在紅細(xì)胞中被識別。小鼠紅細(xì)胞能夠產(chǎn)生硫化氫并表達(dá)CSE蛋白。CSE-/-小鼠的硫化氫生成速率顯著降低。事實(shí)上，外周組織和血清產(chǎn)生的硫化氫可擴(kuò)散至紅細(xì)胞。因此，我們進(jìn)行了野生型與Cse-/-小鼠之間的相互骨髓移植（BMT）。通過BMT生成了三組小鼠：(1)“WTto-Cse-/-”組通過將野生型小鼠骨髓移植至Cse-/-小鼠，以確定除骨髓來源細(xì)胞外，外周組織中CSE的缺乏是否會影響野生型紅細(xì)胞對氧合血紅蛋白（HbO2）的親和力；(2)“Cse-/--to-WT”組通過將Cse-/-小鼠骨髓移植至野生型小鼠，以檢查僅在骨髓來源細(xì)胞中CSE的缺乏是否足以影響Hb-O2親和力；(3)“WT-to-WT”組為野生型小鼠骨髓移植至野生型小鼠。如預(yù)期，“WTto-Cse-/-”小鼠表現(xiàn)出顯著差異。

與“WT-to-WT”和“Cse-/--to-WT”小鼠相比，循環(huán)系統(tǒng)中的硫化氫水平較低（圖2(a)）。相應(yīng)地，“WT-to-Cse-/--”小鼠的紅細(xì)胞2,3-BPG和P50水平顯著高于“WT-to-WT”和“Cse-/--to-WT”小鼠（圖2(b)和2(c)）。GYY4137處理可增加“WT-to-Cse-/--”小鼠循環(huán)中的硫化氫水平（圖2(a)）。“WT-to-Cse-/--”小鼠中升高的紅細(xì)胞2,3-BPG和P50水平被GYY4137逆轉(zhuǎn)（圖2(b)和2(c)）。這些數(shù)據(jù)表明，除骨髓來源細(xì)胞外，外周組織和血清產(chǎn)生的硫化氫對2,3-BPG的生成具有抑制作用，從而維持紅細(xì)胞中的Hb-O2親和力。Cse-/--小鼠表現(xiàn)出高血壓，因?yàn)榱蚧瘹渫ㄟ^控制KATP通道活性是一種重要的血管擴(kuò)張劑。

圖2：2,3-BPG和P50的水平取決于外周組織產(chǎn)生的硫化氫，但與Cse-/-小鼠的血壓無關(guān)。（a–c）在野生型和Cse-/-小鼠之間進(jìn)行了骨髓移植。骨髓移植8周后，“野生型-野生型”和“Cse-/---野生型”小鼠接受了生理鹽水，而“野生型-Cse-/--”小鼠則接受了生理鹽水或GYY4137（133μmol/kg）。治療24小時(shí)后檢測了循環(huán)硫化氫水平(a)、紅細(xì)胞2,3-BPG水平(b)和P50(c)。（d–f）野生型和Cse-/--小鼠接受了匹那西地（2.8μmol/kg）或生理鹽水治療。治療24小時(shí)后檢測了血壓(d)、紅細(xì)胞2,3-BPG水平(e)和P50(f)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=8）。