摘要

胎盤產生的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)增加是先兆子癇發展的主要因素之一。我們之前的研究表明，硫化氫(H2S)抑制胎盤中sFlt-1的釋放。在本研究中，我們旨在調查內源性H2S是否影響sFlt-1的生產，并闡明胎盤中哪種H2S生成酶負責其效應。研究發現，除了胱硫醚β-合酶(CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(CSE)外，3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-MST)也在人胎盤中被鑒定，主要定位在合胞體滋養層細胞中。先兆子癇和正常胎盤中3-MST的表達水平無顯著差異。用NaHS和L-半胱氨酸處理培養的合胞體滋養層細胞，可抑制sFlt-1 mRNA表達，并降低細胞培養基中sFlt-1蛋白含量。用CBS siRNA和CSE siRNA轉染合胞體滋養層細胞，可逆轉L-半胱氨酸的上述效應。此外，NaHS和L-半胱氨酸處理降低了sFlt-1 mRNA的半衰期，并增加了靶向sFlt-1的miR-133b的表達。MiR-133b表達在先兆子癇胎盤中下調，并與CBS和CSE水平相關。這些結果表明，H2S是胎盤中sFlt-1生產的重要調節因子。胎盤中H2S生成減少通過增強sFlt-1生產促進先兆子癇的發展。

1.引言

血管內皮生長因子(VEGF)配體/受體在正常和病理狀態下對內皮功能起關鍵作用。大量研究表明，循環中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平增加是先兆子癇中高血壓和蛋白尿發展的主要因素之一，因為該因子作為VEGF和胎盤生長因子(PlGF)的拮抗劑，通過使它們無法與膜結合受體信號傳導，從而導致內皮功能障礙。胎盤被認為是正常妊娠第三季度循環sFlt-1水平增加約20倍的主要來源。許多研究表明，sFlt-1的生產在先兆子癇胎盤中顯著上調，從而導致母體循環sFlt-1顯著增加。盡管已證明胎盤缺氧和缺血會增加胎盤產生sFlt-1，但調節胎盤中sFlt-1生產的機制仍不清楚。

硫化氫(H2S)是哺乳動物組織中的第三種內源性氣體信號傳導分子，最近被報道由胎盤組織產生。H2S從L-半胱氨酸的合成自然通過酶活性發生，包括胱硫醚γ-裂解酶(CSE,EC 4.4.1.1)和胱硫醚β-合酶(CBS,EC 4.2.1.22)。最近，已證明3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-MST)與半胱氨酸（天冬氨酸）氨基轉移酶(CAT)結合，負責在大腦和血管內皮中從L-半胱氨酸生成H2S。H2S被涉及許多生理和病理過程，包括血管舒張、血管生成和炎癥。一些研究報道，CSE和CBS在人胎盤中表達，并在先兆子癇中下調。此外，Wang等人證明，抑制CSE/H2S信號傳導會導致懷孕小鼠出現先兆子癇特征，包括高血壓和循環sFlt-1水平增加，并且通過CSE siRNA降低CSE表達會導致早期胎盤外植體內皮細胞中sFlt-1釋放增加。最近，我們已顯示H2S供體和前體抑制人胎盤中sFlt-1釋放。然而，哪種H2S生成酶負責其效應以及H2S效應的潛在機制仍有待闡明。盡管CSE和CBS已在胎盤中被鑒定，但3-MST是否在胎盤中有表達尚未報道。在本研究中，我們首先確定了3-MST在人胎盤中的定位，以及正常和先兆子癇胎盤中3-MST的表達水平。然后我們研究了H2S對培養胎盤外植體和細胞中sFlt-1釋放和mRNA表達的影響，并闡明了潛在機制。

2.材料與方法

2.1.組織獲取

人胎盤組織來自2010年至2012年在第二軍醫大學附屬長海醫院接受選擇性剖宮產的先兆子癇孕婦和健康孕婦。組織收集經第二軍醫大學生物醫學研究倫理專業委員會批準。獲得所有患者的知情同意。本研究招募了足月健康女性(n=23)和先兆子癇女性(n=19)。這些患者的妊娠和先兆子癇指數信息先前已報道。所有胎盤樣本在剖宮產后1小時內收集，每個胎盤隨機取兩個獨立小葉的小組織塊。組織用生理鹽水洗滌，立即在液氮中冷凍，然后儲存于-80°C。

2.2.免疫組化

免疫組化如先前所述進行。簡要地，切片在4°C下與針對CSE、CBS或3-MST的抗體（稀釋1:200-500）在含1%BSA的PBS中孵育24小時。結合的抗體通過生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶系統（UltraSensitive-SP-kit,MaiXin Biotechnology,Fuzhou,China）檢測，使用二氨基聯苯胺（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）作為顯色劑。用蘇木精進行復染。陰性對照通過用十倍過量的阻斷肽預吸收一抗進行替代。使用了來自Santa Cruz（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）和Abnova（Novus Biologicals,Cambridge,UK）的兩種CSE抗體，以及來自Santa Cruz和Sigma-Aldrich的兩種CBS抗體。3-MST抗體購自Santa Cruz。

2.3.胎盤細胞培養

原代滋養細胞根據改良的Kliman方法培養，如先前所述。簡要地，絨毛組織切碎，然后用0.125%胰蛋白酶（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）和0.02%脫氧核糖核酸酶-I（Sigma-Aldrich）在無酚紅DMEM（Sigma-Aldrich）中消化。分散細胞中的細胞滋養細胞通過不連續Percoll（Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden）梯度（5-70%）獲得。然后將細胞以1.2 x 10^6/孔的密度接種到十二孔板（Corning）中，并在含10%胎牛血清（FCS）的無酚紅DMEM中于37°C、5%CO2-95%空氣下生長。孵育48小時后，培養基更換為含以下處理之一的無FCS DMEM：NaHS（1-8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（2.5-20 x 10^-4 M）。每種處理在每次細胞制備中重復三次。上述試劑的濃度基于文獻、我們之前的研究和初步數據確定。培養細胞固定并用針對細胞角蛋白7的一抗（Santa Cruz）以1:200稀釋進行免疫染色以評估細胞純度。結果顯示胎盤細胞培養主要為細胞角蛋白7陽性（>95%）。