2.4.總RNA提取和定量實(shí)時(shí)RT-PCR


總RNA提取和定量實(shí)時(shí)RT-PCR如先前所述進(jìn)行。簡(jiǎn)要地，總RNA通過(guò)TRIzol試劑（Invitrogen）提取，然后通過(guò)超轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。定量實(shí)時(shí)PCR使用MiniOpticonTM實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（BioRad,Hercules,CA）進(jìn)行。反應(yīng)溶液由2.0μl稀釋cDNA、0.2μM每對(duì)引物和1x PCR Master Mix（TaKaRa,Otsu,Japan）組成。管家基因β-肌動(dòng)蛋白和18s-RNA的擴(kuò)增作為樣品加載和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參測(cè)量。檢測(cè)PCR產(chǎn)物熔解溫度的溫度范圍設(shè)定為60至95°C。使用比較Ct（閾值循環(huán)）方法與算術(shù)公式（2^-ΔΔCt）確定靶基因和管家基因的相對(duì)定量。


胎盤(pán)組織和細(xì)胞的總miR使用miRcute miRNA分離試劑盒（TIANGEN,China）根據(jù)制造商說(shuō)明提取。總miRNA的第一鏈cDNA合成使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（TIANGEN,China）進(jìn)行。miR的定量通過(guò)miRcute miRNA qPCR檢測(cè)試劑盒（TIANGEN,China）進(jìn)行。管家基因U6的擴(kuò)增作為樣品加載和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參測(cè)量。檢測(cè)PCR產(chǎn)物熔解溫度的溫度范圍設(shè)定為60至95°C。使用比較Ct方法與算術(shù)公式（2^-ΔΔCt）確定miR表達(dá)的相對(duì)定量。


本研究中使用的引物如表1所示。


表1: 本研究中使用的引物序列
登錄號(hào) 靶基因 方向 引物序列 (5′→3′)
NM_001101 β-actin 正義 TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG
NM_001101 β-actin 反義 GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG
NM_001159920 sFlt-1 正義 TTGGGACTGTGGGAAGAAC
NM_001159920 sFlt-1 反義 TTGGAGATCCCAGAGAAAACA
NR_003286.3 18s-RNA 正義 CAGCCACCCGACGATTGAGCA
NR_003286.3 18s-RNA 反義 TAGTAGCGACGGGCGGTGTG
NR_004394.1 U6 正義 GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT
NR_004394.1 U6 反義 CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT
MI0000822 miR-133b 正義 TTTGGTCCCCTTCAACCAGCTA

2.5.蛋白質(zhì)印跡分析


約100 mg組織在含蛋白酶抑制劑混合物片（Roche,Indianapolis,IN）的冷RIPA裂解緩沖液中勻漿。培養(yǎng)細(xì)胞在存在上述緩沖液的情況下從板上刮下。30μg蛋白樣品通過(guò)10%SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜在4°C下與針對(duì)CBS（Abcam）、CSE（Abcam）或3-MST（Santa Cruz）的抗體孵育過(guò)夜，然后洗滌并與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（Santa Cruz）孵育。免疫反應(yīng)蛋白通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)（Santa Cruz）可視化。化學(xué)發(fā)光信號(hào)通過(guò)GeneGnome HR掃描儀使用GeneTools軟件（SynGene）定量。獲得條帶強(qiáng)度與GAPDH的比率以量化相對(duì)蛋白表達(dá)水平。


2.6.實(shí)時(shí)H2S生產(chǎn)測(cè)量


約100 mg胎盤(pán)組織或培養(yǎng)細(xì)胞樣品置于含蛋白酶抑制劑（2 mM苯甲基磺酰氟、1 mM原釩酸鈉和10μg/ml抑肽酶）的PBS中冰上。組織勻漿并在4°C離心，然后收集上清液。實(shí)時(shí)H2S生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)通過(guò)使用微型硫化氫電極（Model H2S-MRCh,Unisense,Aarhus,Denmark）耦合到Unisense PA2000放大器（Zhu等人，2013）測(cè)定。


簡(jiǎn)要地，測(cè)量在溫度控制的微呼吸室（Unisense）中進(jìn)行。電極信號(hào)穩(wěn)定后，添加L-半胱氨酸（1 mmol/L）和吡哆醛-5'-磷酸（PLP,1 mmol/L），一種生成H2S的輔因子。H2S生產(chǎn)率然后在每條軌跡的最陡初始斜率處確定。在某些情況下，添加CSE抑制劑DL-丙炔甘氨酸（PAG）和CBS抑制劑氨基氧乙酸半鹽酸鹽（AOAA）。所有上述試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich。


2.7.RNA干擾


針對(duì)CSE和CBS的siRNA由GenePharma公司（Shanghai,China）合成。對(duì)照siRNA是無(wú)任何特定靶點(diǎn)的亂序序列。針對(duì)人CSE和CBS的序列為：CSE正義：5'-GGCCUUUGCUUCAGGUUUATT-3'，反義：5'-UAAACCUGAAGCAAAGGCCTT-3'；CBS正義：5'-CGGAACUACAUGACCAAGUTT-3'，反義：5'-ACUUGGUCAUGUAGUUCCGTT-3'。原代胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞使用LipofectamineTM 2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染CSE siRNA、CBS siRNA和對(duì)照siRNA。我們已顯示CSE和CBS siRNA分別導(dǎo)致CSE減少約65%和CBS減少約70%。轉(zhuǎn)染CBS siRNA和CSE siRNA后，細(xì)胞然后用L-半胱氨酸處理，孵育24小時(shí)后收集培養(yǎng)基。


2.8.sFlt-1 mRNA穩(wěn)定性評(píng)估


原代滋養(yǎng)細(xì)胞用NaHS（8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（2 x 10^-3 M）處理12小時(shí)。然后通過(guò)5,6-二氯苯并咪唑1-β-d-ribofuranoside（DRB,Sigma-Aldrich）在2.5 x 10^-5 M停止轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞在離散時(shí)間點(diǎn)（0-8小時(shí)）收集。


2.9.miR靶點(diǎn)驗(yàn)證


胎盤(pán)細(xì)胞在48孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用miR模擬物或抑制劑（20nM/孔）轉(zhuǎn)染24小時(shí)使用LipofectamineTM 2000。收集細(xì)胞和培養(yǎng)基用于測(cè)定培養(yǎng)基中sFlt-1蛋白水平和細(xì)胞中mRNA水平。miR-133b的模擬物和抑制劑由Gene Pharma公司（Shanghai,China）合成。


sFlt-1的3'-UTR片段（600bp）含miR-133b結(jié)合位點(diǎn)和突變sFlt-1的3'-UTR片段插入Psi-CHECK2載體（Promega）。胎盤(pán)細(xì)胞在存在或不存在miR-133b模擬物的情況下使用Lipofectamine TM 2000共轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega）測(cè)量螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶活性。螢火蟲(chóng)熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。


2.10.統(tǒng)計(jì)分析


數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。在某些情況下，結(jié)果為說(shuō)明目的表示為平均百分比對(duì)照±標(biāo)準(zhǔn)誤。所有數(shù)據(jù)在分析顯著性前通過(guò)Bartlett檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。個(gè)體比較通過(guò)單因素方差分析后進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)（對(duì)于正態(tài)分布數(shù)據(jù)）。對(duì)于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)顯著性檢驗(yàn)。在所有檢驗(yàn)中，P<0.05被認(rèn)為顯著。


3.結(jié)果


3.1.3-MST在胎盤(pán)中有表達(dá)


我們確認(rèn)了CBS和CSE在胎盤(pán)中有表達(dá)。CSE和CSE的陽(yáng)性染色在合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（圖1A&B）。3-MST在胎盤(pán)中被鑒定，并定位到合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖1C）。由于一些研究顯示關(guān)于人胎盤(pán)中CSE和CSE定位的矛盾數(shù)據(jù)，我們使用來(lái)自兩個(gè)公司的CSE和CSE抗體進(jìn)行免疫組化。顯示，由任一抗體識(shí)別的CSE和CSE免疫反應(yīng)性主要定位在合胞體滋養(yǎng)層和內(nèi)皮（圖1）。

圖1. 人胎盤(pán)中CBS、CSE和3-MST的表達(dá)情況。A-F圖通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)分析展示了健康胎盤(pán)與子癇前期胎盤(pán)中CBS（A&D）、CSE（B&E）和3-MST（C&F）的陽(yáng)性染色代表性切片。G-I圖顯示陰性對(duì)照切片，這些切片使用與對(duì)應(yīng)阻斷肽（G&H）或IgG(I)預(yù)孵育10倍過(guò)量的一抗制備。箭頭指示合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的陽(yáng)性染色，箭頭頭指示血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽(yáng)性染色。原始放大倍數(shù)為200倍。

我們之前的研究顯示，先兆子癇胎盤(pán)中CBS和CSE的蛋白水平顯著低于健康胎盤(pán)。一致地，免疫組化顯示，先兆子癇胎盤(pán)中CBS和CSE的免疫染色水平低于正常血壓胎盤(pán)（圖1A&D,B&F）。我們?nèi)缓鬁y(cè)定了先兆子癇胎盤(pán)中3-MST的水平，并與正常血壓胎盤(pán)比較。如圖2A&B所示，3-MST mRNA和蛋白表達(dá)在健康和平先兆子癇胎盤(pán)之間無(wú)顯著差異。為了確認(rèn)先兆子癇胎盤(pán)中H2S生產(chǎn)是否減少，進(jìn)行了H2S生產(chǎn)測(cè)量。發(fā)現(xiàn)先兆子癇胎盤(pán)中H2S生產(chǎn)率顯著降低（圖2C,P<0.01 vs正常組）。

圖2. 健康與子癇前期胎盤(pán)中3-MST和硫化氫生成速率的水平。胎盤(pán)組織取自健康（n ? 23）和子癇前期（n ? 19）孕婦。A，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定3-MST的mRNA水平。B，通過(guò)Western blotting測(cè)定3-MST的蛋白水平。代表性蛋白條帶顯示在相應(yīng)直方圖頂部。C，人類(lèi)正常與子癇前期胎盤(pán)中硫化氫的生成速率。上圖，胎盤(pán)組織勻漿中硫化氫生成的代表性曲線。下圖，正常與子癇前期胎盤(pán)中硫化氫生成速率的累積數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。**P < 0.01。