討論

本研究調(diào)查了與固定化在鈣藻酸鹽珠中的乳酸乳球菌亞種lactis NCIMB 6681生長和釋放相關(guān)的現(xiàn)象。根據(jù)先前研究，乳酸在珠內(nèi)部積累隨著固定化乳酸菌生長。這種積累導(dǎo)致珠內(nèi)部pH降低，結(jié)合高濃度未解離乳酸，最終抑制珠內(nèi)部生長。在本研究中，這種發(fā)展通過連續(xù)發(fā)酵珠的生物量分布分析證明，因為珠內(nèi)部濃度在初始發(fā)酵期后保持不變。在珠外圍，高生物量濃度在連續(xù)發(fā)酵前12小時內(nèi)似乎穩(wěn)定。在珠表面附近約150μm厚的層中測量到70 g干重l?1的生物量濃度。這些值略低于報道的值在研究固定化在鈣藻酸鹽珠中的L.lactis亞種lactis bv.diacetylactis時。然而，在本研究中，珠的較大部分可能已在每層溶解。數(shù)學(xué)模擬表明極高濃度的生物量位于珠表面附近非常窄的層中。如果珠的較大部分被溶解，高濃度區(qū)域可能已與珠內(nèi)部較少生物量密度的區(qū)域平均。這可能解釋了本研究中觀察到的值與先前報道值之間的差異。

珠表面附近的生物量濃度似乎隨連續(xù)發(fā)酵延長而穩(wěn)定。比較連續(xù)發(fā)酵12和48小時的珠，最外層生物量濃度未觀察到變化。這些觀察與報道的觀察和模擬一致。不同尺寸珠的連續(xù)發(fā)酵實驗結(jié)果表明大多數(shù)生長和乳酸生產(chǎn)發(fā)生在珠表面附近狹窄范圍內(nèi)。此區(qū)域和珠整體似乎達(dá)到穩(wěn)態(tài)生物量濃度。這些觀察表明，當(dāng)生長發(fā)生時，過量生物量釋放到周圍介質(zhì)中。這種自由細(xì)胞釋放可能可取或不可取。已提出幾種方法來減少乳酸菌從藻酸鹽珠釋放。一種方法是在發(fā)酵前用蒸餾水、乙醇、Al(NO?)或熱CaCl?溶液沖洗包含固定化乳酸菌的藻酸鹽珠以殺死珠表面附近細(xì)菌。另一種方法是應(yīng)用多層聚L-賴氨酸和藻酸鹽涂層，將細(xì)胞釋放減少10倍。還有一種方法研究了使用殼聚糖減少細(xì)胞釋放。報道在重復(fù)2小時牛奶發(fā)酵中，殼聚糖涂層藻酸鹽珠的自由細(xì)胞數(shù)量比未涂層珠減少。先前研究了順序涂層殼聚糖和藻酸鹽的使用，在整個調(diào)查的48小時連續(xù)發(fā)酵期間減少了體積基準(zhǔn)細(xì)胞釋放速率。本研究調(diào)查了利用擴散限制和相應(yīng)的固定化生長乳酸菌珠內(nèi)pH梯度來影響固定化細(xì)胞發(fā)展及其伴隨釋放的可能性。

乳酸菌的生長速率取決于生長介質(zhì)中的pH值。測定pH 6.5是自由懸浮L.lactis亞種lactis NCIMB 6681在此培養(yǎng)基中的最適生長pH。當(dāng)pH升高above 7.5時生長速率迅速下降，在pH 9.00未觀察到生長。在固定化L.lactis亞種lactis發(fā)酵中將控制pH從6.50調(diào)整到9.25導(dǎo)致細(xì)胞釋放速率與乳酸生產(chǎn)速率的比值初始減少約10倍，相比在細(xì)菌生長最適pH下運行的發(fā)酵。這種發(fā)酵pH改變顯然改變了內(nèi)部pH梯度和L.lactis亞種lactis在珠內(nèi)的分布模式。從圖7可見，在發(fā)酵24小時后測量的珠最外部pH梯度剖面在pH 9.00和9.25下發(fā)酵的珠中有顯著差異。在pH 9.25下發(fā)酵的珠中，珠最外部0.4 mm內(nèi)pH僅輕微降低，而pH梯度在pH 9.00下發(fā)酵的珠內(nèi)似乎下降更迅速。在pH 9.25下發(fā)酵的珠最外部觀察到的表觀pH閾值層與生物活性小的層一致，因為此層局部pH above 9.00。在此pH下未觀察到自由懸浮L.lactis亞種lactis NCIMB 6681生長。生物量分布分析和不同尺寸珠發(fā)酵結(jié)果表明大多數(shù)生長和乳酸生產(chǎn)發(fā)生在珠表面附近當(dāng)發(fā)酵在正常pH下進行時。因此，釋放細(xì)胞只需破裂很少凝膠。增加pH似乎將生長最適pH區(qū)移向珠中心，遠(yuǎn)離表面。如果生長發(fā)生在珠內(nèi)部，釋放細(xì)胞必須破裂更多凝膠材料。這種機制可能解釋了在pH 9.25下運行的發(fā)酵中觀察到的減少細(xì)胞釋放速率。

事實上，視覺檢查在pH 9.25下連續(xù)發(fā)酵46小時的珠確實揭示了表面下包含大量松散結(jié)合生物量的層。固定化細(xì)菌的強烈生長似乎削弱了此區(qū)域的藻酸鹽凝膠。藻酸鹽凝膠層位于此層外部，有效阻擋了下層生物量的釋放。這種情況可能與用額外無細(xì)胞藻酸鹽層涂層珠的發(fā)酵甚至藻酸鹽膠囊相比。幾位作者報告了使用額外無細(xì)胞藻酸鹽層涂層珠減少細(xì)胞釋放。Klinkenberg等人也研究了從包含固定化L.lactis亞種lactis的藻酸鹽涂層藻酸鹽珠的細(xì)胞釋放在連續(xù)發(fā)酵中。在那項研究中，細(xì)胞釋放速率與乳酸生產(chǎn)速率的比值顯著減少在整個48小時發(fā)酵期間明顯。然而，那些發(fā)酵早期階段觀察到的效果不如本研究中觀察到的那么大。

我們的結(jié)果表明，可以選擇狹窄的操作pH窗口，促進細(xì)胞釋放減少和珠內(nèi)生物量分布變化。這種效應(yīng)已在幾個實驗系列中證明，盡管pH測量和控制的變異以及窗口的狹窄給出了效果出現(xiàn)的確切pH值略有不同。發(fā)酵介質(zhì)pH必須控制的方式使得生長速率在自由介質(zhì)以及珠外圍嚴(yán)重抑制，而生長可能在珠內(nèi)部受pH梯度保護繼續(xù)。當(dāng)介質(zhì)pH首次增加時，觀察到細(xì)胞釋放速率的初始減少。此初始期可能對導(dǎo)致長期減少細(xì)胞釋放的過程關(guān)鍵。生長和乳酸生產(chǎn)在pH增加時同時減少。由于珠內(nèi)部產(chǎn)生的乳酸必須擴散出來，珠內(nèi)部pH降低。這可能保護此區(qū)域細(xì)胞并允許繼續(xù)生長。然而，如果pH增加太高或突然，乳酸生產(chǎn)也將被抑制，保護性pH梯度將消失。如果pH增加太小，外圍細(xì)胞生長將暫時抑制，但內(nèi)部和表面乳酸生產(chǎn)可能降低局部pH足夠恢復(fù)外部區(qū)域生長和乳酸生產(chǎn)。在此提出的實驗中，在達(dá)到選定操作pH前應(yīng)用了短保持期在pH 6.50下2小時，然后進行單步改變。其他程序可能可行，例如一系列逐步改變以達(dá)到操作pH，這可能擴展此pH窗口以產(chǎn)生此處為pH 9.25案例看到的效果。

然而，特殊生長條件的要求可能在某些食品應(yīng)用中排除這種減少細(xì)胞釋放的方法。但是，其他可能應(yīng)用現(xiàn)在可能由于這種擴展的pH操作范圍而可用。先前已報告固定化乳酸菌在短時間暴露于極端pH值后可以維持高活性。從圖3、5和7的一個有趣觀察是，高細(xì)胞釋放和乳酸生產(chǎn)速率維持在通常會導(dǎo)致自由細(xì)胞培養(yǎng)生長速率嚴(yán)重抑制的pH值。在pH值above 8.5時，自由細(xì)胞培養(yǎng)中的生長速率可忽略，而細(xì)胞釋放速率和乳酸生產(chǎn)速率在固定化發(fā)酵中未顯著影響。事實上，似乎在pH 8.50、8.75和9.00下實現(xiàn)的穩(wěn)態(tài)乳酸生產(chǎn)速率和內(nèi)部細(xì)胞密度大于在pH 6.50下實現(xiàn)的值。這些差異出現(xiàn)即使自由細(xì)胞生長應(yīng)在此貢獻在pH 6.50下測量的細(xì)胞釋放速率。在pH 6.50下約18-22%的自由細(xì)胞源自反應(yīng)器中自由細(xì)胞生長。在pH值above 8.5時，自由細(xì)胞生長可能不顯著貢獻總自由細(xì)胞濃度由于發(fā)酵broth中的惡劣條件。因此，可能利用擴散限制與伴隨的pH梯度來應(yīng)用固定化發(fā)酵于涉及惡劣條件的工藝，這些條件對固定化生物量提供一定保護和穩(wěn)定效果，但有效防止污染生物生長。

結(jié)論

本研究證明了通過控制外部pH值可以顯著影響固定化乳酸乳球菌在藻酸鹽珠中的分布和釋放行為。將發(fā)酵pH從6.5提升至9.25能夠：

?將細(xì)胞釋放速率與乳酸生產(chǎn)速率的比值降低近10倍

?使珠內(nèi)生物量濃度提高5倍

?將乳酸生產(chǎn)速率提升25%

這些發(fā)現(xiàn)表明，通過利用固定化系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的pH梯度，可以創(chuàng)造有利于珠內(nèi)部生長而不利于珠外圍生長的條件，從而有效控制細(xì)胞釋放。這種方法不僅為減少細(xì)胞釋放提供了新策略，還擴展了固定化細(xì)胞技術(shù)在惡劣pH條件下的應(yīng)用潛力，為生物工藝設(shè)計提供了重要見解。