好氧甲烷氧化細(xì)菌是一組多樣化的微生物，在自然環(huán)境中無處不在。與厭氧甲烷氧化菌和古菌一起，好氧甲烷氧化菌對于減弱甲烷向大氣的排放至關(guān)重要。顯然，銨鹽和亞硝酸鹽形式的氮有效性對甲烷氧化菌的活性及其自然群落結(jié)構(gòu)有強(qiáng)烈影響。先前的研究結(jié)果表明，添加亞硝酸鹽會抑制某些已培養(yǎng)甲烷氧化菌的活性；然而，允許某些菌株轉(zhuǎn)化亞硝酸鹽的生理途徑、基因庫存的表達(dá)以及支持此活性的電子源在很大程度上仍未得到表征。本文表明，Methylomicrobium album菌株BG8僅在缺氧且存在亞硝酸鹽的情況下，利用甲烷、甲醇、甲醛、甲酸鹽、乙烷、乙醇和氨來支持脫氮活性。我們還證明，推定的脫氮基因nirS和兩個(gè)norB基因之一的轉(zhuǎn)錄本豐度響應(yīng)亞硝酸鹽而增加。此外，我們發(fā)現(xiàn)推定的含銅單加氧酶α亞基編碼基因pxmA的轉(zhuǎn)錄本豐度響應(yīng)亞硝酸鹽和缺氧而增加。我們的結(jié)果表明，在好氧甲烷氧化菌基因組中廣泛存在的脫氮基因的表達(dá)，使得在氧限制下能夠?qū)⒌孜镅趸c氮氧化物末端電子受體的還原相耦合。本研究通過揭示在缺氧條件下，多種電子供體支持亞硝酸鹽還原為一氧化二氮，擴(kuò)展了當(dāng)前對甲烷氧化菌代謝靈活性的認(rèn)識。

引言

好氧甲烷氧化細(xì)菌在全球碳氮循環(huán)之間架起了一座重要的橋梁，這種關(guān)系受到全球氮肥使用的影響。氨和硝酸鹽可以通過作為生長和生物量生產(chǎn)的氮源來刺激甲烷氧化菌的活性。此外，一些甲烷氧化菌如Methylomonas denitrificans在缺氧條件下利用硝酸鹽作為呼吸作用的氧化劑。

顯然，好氧甲烷氧化菌中的脫氮作用在氧限制期間起到保存能量的功能。或者，氨和亞硝酸鹽可以作為甲烷氧化細(xì)菌的顯著抑制劑。氨是甲烷單加氧酶的競爭性抑制劑，而由能氧化氨生成亞硝酸鹽的甲烷氧化菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽是一種具有抑菌特性的毒素，已知能抑制甲烷氧化菌將甲酸鹽氧化為二氧化碳所必需的甲酸脫氫酶。

盡管最近發(fā)現(xiàn)好氧甲烷氧化菌能夠進(jìn)行脫氮作用，但支配MOB中脫氮作用的能量來源、遺傳模塊和環(huán)境因素仍然知之甚少。M.denitrificans FJG1利用甲烷作為電子供體呼吸硝酸鹽以保存能量。然而，除甲烷以外的其他C1能源是否可以直接支持脫氮作用尚不清楚。另一種尚未研究的可能性是，C2化合物和無機(jī)還原氮源支持甲烷氧化菌的脫氮作用。先前的工作表明，幾種專性甲烷氧化菌，包括Methylomicrobium album菌株BG8，利用顆粒性甲烷單加氧酶和甲醇脫氫酶分別氧化乙烷和乙醇，盡管這兩種底物都不支持生長。氨可能能夠支持甲烷氧化菌的脫氮作用，因?yàn)樵S多好氧甲烷氧化菌能夠?qū)毖趸蓙喯跛猁}：這一過程由存在含銅單加氧酶酶以及在某些甲烷氧化菌中存在羥胺脫氫酶同系物所促進(jìn)。利用替代能源支持脫氮作用的能力將增強(qiáng)甲烷氧化菌的代謝靈活性，并使它們能夠在缺乏甲烷和/或氧氣的情況下維持呼吸作用。

Methylomicrobium album菌株BG8是一種屬于γ-變形菌門的好氧甲烷氧化菌；其基因組缺少可溶性甲烷單加氧酶，但包含一個(gè)顆粒性甲烷單加氧酶操縱子和一個(gè)編碼功能未知的推定性銅單加氧酶的操縱子。該基因組還包含用于銨鹽的導(dǎo)入和同化、硝酸鹽的同化、羥胺氧化為亞硝酸鹽以及推定的脫氮基因模塊——細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶和兩個(gè)拷貝的細(xì)胞色素c依賴性一氧化氮還原酶。最近幾個(gè)好氧甲烷氧化菌基因組序列的發(fā)布，包括M.album菌株BG8，表明推定的亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶頻繁存在，而只有三種已培養(yǎng)的甲烷氧化菌擁有呼吸性硝酸鹽還原酶。目前也不清楚缺乏呼吸性硝酸鹽還原酶但擁有異化亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶的甲烷氧化菌是否仍然能夠從亞硝酸鹽進(jìn)行脫氮作用。此外，由于甲烷氧化菌nirS與已知序列存在顯著差異，尚不清楚nirS是否是缺乏nirK的甲烷氧化菌中起作用的亞硝酸鹽還原酶。雖然硝酸鹽呼吸菌M.denitrificans FJG1的基因組編碼了nirS和nirK兩種亞硝酸鹽還原酶，但只有nirK的轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)脫氮條件而增加。

本研究的目標(biāo)是測試多種C1、C2和無機(jī)能源是否能直接支持脫氮作用，表征調(diào)節(jié)M.album菌株BG8中依賴NO2-的N2O產(chǎn)生的環(huán)境因素，并評估其推定的脫氮基因庫存的表達(dá)。

材料與方法

培養(yǎng)

Methylomicrobium album菌株BG8在含有11 mM KNO3的硝酸鹽礦物鹽培養(yǎng)基或含有10 mM KNO3加1 mM NaNO2的培養(yǎng)基中，于300 mL玻璃Wheaton瓶（配丁基橡膠塞）中培養(yǎng)100 mL。NMS培養(yǎng)基使用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至pH 6.8。銅的最終濃度為5μM。使用60 mL注射器和0.22μm過濾器/針頭組件，將CH4作為唯一碳源添加到密封瓶中。頂空初始?xì)怏w混合比例使用O2氣體調(diào)整為CH4:O2=1.6:1。氣密瓶中的初始壓力調(diào)整至約1.3大氣壓，以防止在生長過程中因抽取氣體和液體培養(yǎng)樣品而產(chǎn)生真空。培養(yǎng)物在30°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)。為了追蹤生長，定期使用帶針頭的注射器取樣（0.5 mL），并通過相位對比顯微鏡使用Petroff-Hausser計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞密度。在單獨(dú)的日子培養(yǎng)六個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并對每個(gè)重復(fù)收集數(shù)據(jù)。通過16S rRNA基因測序、相位對比顯微鏡檢查以及在營養(yǎng)瓊脂和TSA上平板培養(yǎng)（無生長表明無污染）來評估培養(yǎng)物純度。我們在開始所有實(shí)驗(yàn)前評估培養(yǎng)物純度，并在每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)再次評估。

氣體分析

通過使用氣相色譜法對每個(gè)培養(yǎng)物的頂空取樣來測定O2、CH4和N2O的濃度。在每個(gè)批次培養(yǎng)的0（接種后立即）、6、12、16、20、24、30、36、42、48、60、72、96和120小時(shí)對每個(gè)重復(fù)的頂空取樣。通過將一組未接種的重復(fù)瓶在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間留置并測量頂空氣體濃度來確定瓶子的氣密性；120小時(shí)內(nèi)泄漏率<1%。使用純氣體O2、CH4和N2O生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算批次培養(yǎng)中的頂空濃度。

瞬時(shí)微電極測定

Methylomicrobium album菌株BG8使用上述NMS+NO2-培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)。在生長96小時(shí)，脫氮活性明顯時(shí)，使用過濾歧管將4 x 10^10個(gè)細(xì)胞收獲到0.2μm過濾器上。將生物質(zhì)用無菌、無氮礦物鹽培養(yǎng)基洗滌三次。對于圖2和圖4所示數(shù)據(jù)，將洗滌后的生物質(zhì)重懸于相同的無氮培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至配備有OX-MR 氧微電極和N2O-500 氧化亞氮微電極的氣密10 mL微呼吸室中。

對于圖3所示數(shù)據(jù)，將生物質(zhì)重懸于添加了100μM NaNO2的礦物鹽培養(yǎng)基中。使用SensorTrace Basic軟件記錄數(shù)據(jù)。將CH4氣體、0.001%CH3OH、0.01%CH2O、10 mM HCO2H、C2H6氣體、0.01%C2H6O、200 mM NH4Cl和/或1 M NO2-通過氣密注射器直接注入腔室的針頭注射口。在圖3B-E中，分別在添加CH4、CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6、C2H6O之前，將溶解氧降低至<100μmol/L和<25μmol/L，然后啟用數(shù)據(jù)記錄以限制追蹤時(shí)間在100分鐘以內(nèi)并減少采樣點(diǎn)數(shù)量。使用比色法測定NO2-濃度。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3-4次以證明結(jié)果的可重復(fù)性，并選擇單個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行展示。