圖1、左：本研究中使用的鈷氧化肟：[Co（dmgH）2Cl2]（1），和[Co（dmgH）2（py）Cl]（2）。中心：基于相關(guān)蛋白系統(tǒng)2MP-α3 C（2MP=2-巰基酚），RSCB PDB ID 2LXY的3-MePy-α3 C（3-MePy=3-甲基吡啶）結(jié)構(gòu)模型。α3腳手架中的螺旋1、2和3分別以青檸綠、藍(lán)色和灰褐色呈現(xiàn)。右圖：基于3-MePy-α3C的人工氫化酶模型。

圖2、復(fù)雜體3的特征描述。（A）使用辛那匹酸基質(zhì)進(jìn)行α3C、3-MePy-α3C和α3Y的MALDI-ToF-MS光譜儀。每個(gè)樣品的計(jì)算質(zhì)量（mc）和觀測(cè)質(zhì)量（m/z）如下：α3C（mc=7460.8，m/z=7458.9）、3-MePy-α3C（mc=7551.9，m/z=7550.5）、α3Y（mc=7520.8，m/z=7520.1）。

（B）圓二色性譜，單位為平均剩余摩爾橢圓度[Θ]，適用于50 mM KP、pH 7.0±0.1中的α3W（黑色點(diǎn)劃線）、α3C（實(shí)心黑色）和3（青綠色）。

（C）冷凍溶液化學(xué)還原樣品的X波段EPR光譜，2?和3?。光譜記錄在T=7 K，使用1毫瓦微波功率。

（D）堆疊的循環(huán)伏安圖，包括100 mM KP pH 7緩沖液（掃描A，灰色）、α3C蛋白膜（掃描b，黑色）、3-MePy-α3C蛋白膜（掃描c，粉色）、0.47 mM 1（掃描1，紫色）、100 mM MES、100 mM MOPS、75 mM KCl緩沖液（掃描D，灰色）、蛋白膜3（掃描3，青綠色）和1.0 mM 2蛋白膜（掃描2，橙色）。CVsa–c和CV1在100 mM KP、pH 7.0±0.1緩沖液中記錄。CVd、2和3采集于100 mM MES、100 mM MOPS pH 7.0緩沖液中。所有測(cè)量均采用250 mV s?1的掃描速率。

圖3（A）光激活HER的反應(yīng)方案。（B）H2由2（a，橙色）和3（b，青綠色）在光催化條件下pH 6.2產(chǎn)生。通過H2感應(yīng)電極檢測(cè)。（C）在反應(yīng)完備時(shí)，在pH條件下的頭間檢測(cè)到H2。

圖4、通過添加化學(xué)還原劑[Eu（EGTA）]誘導(dǎo)的HER 2（面板A和B）和3（面板C和D）。pH值為7（面板A和C）或8（面板B和D）。每個(gè)光跡代表獨(dú)立的檢測(cè);粗體為光線痕量的平均值。

圖5、通過克拉克型氫傳感器檢測(cè)到的化學(xué)式氫析出現(xiàn)象。氫氣在化學(xué)還原劑[Eu(EGTA)]2-的存在下由2和3發(fā)生演變。亮色痕跡是單獨(dú)的測(cè)量值；暗色痕跡則是重復(fù)測(cè)量的平均值。1至15號(hào)痕跡是在同一天記錄的，因此更具可比性。16至18號(hào)痕跡是在另一天記錄的。數(shù)字與表S1中的樣本編號(hào)相對(duì)應(yīng)。陰影灰色區(qū)域顯示了用于繪制線性曲線以確定表1中所報(bào)告的氫產(chǎn)量速率的數(shù)據(jù)。（A）復(fù)合物2，pH值7。（B）復(fù)合物2，pH值8。（C）復(fù)雜物3，pH值7。（D）復(fù)雜物3，pH值8。（E）復(fù)雜物3，在不同日期的pH值為7時(shí)的情況。（F）所有氫氣釋放痕跡（4-7—藍(lán)色，痕跡4-7）以及（16-18—紫色，痕跡16-18）均針對(duì)pH值為7的3號(hào)樣品。

結(jié)論與展望

基于豐富元素且能在中性水中發(fā)揮作用的分子催化劑，是可持續(xù)氫氣生產(chǎn)的重要組成部分。基于蛋白質(zhì)-無機(jī)雜交的人工氫化酶已成為這一目的中一類引人注目的催化劑。研究人員制備了一種基于鈷肋的新型人工氫酶，通過基于吡啶的非天然氨基酸結(jié)合到新生的三α螺旋蛋白α3C。功能化的新生蛋白通過紫外可見光譜、CD光譜和EPR光譜以及MALDI光譜法進(jìn)行了表征，確認(rèn)鈷氧肟與該蛋白的存在及連接。

新的新酶在中性水溶液中通過電化學(xué)、光化學(xué)和還原化學(xué)條件下生成氫。與天然鈷氧化肟相比，新酶的氫演化能力發(fā)生變化，周轉(zhuǎn)率約為鈷氧化肟的80%，氫的演化率為鈷氧化肟的40%。

本研究為如何為鈷氧化羋作為蛋白質(zhì)環(huán)境中氫演化催化劑的功能提供重要信息，以及利用新生蛋白開發(fā)人工金屬酶的可行性。作為酶支架的小型新生蛋白具有作為高效原子經(jīng)濟(jì)性，具有作為可升級(jí)生物啟發(fā)催化劑的潛力，而本文的研究結(jié)果表明，這類新型酶是可能的產(chǎn)物。

Unisense公司的氫氣微傳感器（H?）來監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中由鈷肟催化劑（游離態(tài)2或蛋白結(jié)合態(tài)3）在[Eu(EGTA)]2?還原條件下產(chǎn)生的氫氣。通過實(shí)時(shí)測(cè)量H?積累速率和總量，研究人員得以計(jì)算出人工酶（復(fù)合物3）與對(duì)照催化劑（復(fù)合物2）的產(chǎn)氫轉(zhuǎn)化數(shù)（TON），從而客觀比較其催化效率。Unisense氫氣微電極在本研究中作為核心檢測(cè)設(shè)備，提供了關(guān)鍵的動(dòng)力學(xué)與定量數(shù)據(jù)，直接支撐了人工酶產(chǎn)氫功能的驗(yàn)證與性能評(píng)估，是連接分子設(shè)計(jì)與催化功能表征的重要技術(shù)橋梁。