材料與方法

菌株和質(zhì)粒

使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法。使用的引物列于補(bǔ)充材料表S2。通過使用λRed協(xié)議構(gòu)建非極性突變體，使所有突變處于相同遺傳背景。為構(gòu)建攜帶Δcra突變的菌株，用NEB Phusion聚合酶和引物JcraredF和JcraredR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。為ΔkdpE突變，用引物kdpEARed-F和kdpEλRed-R擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。

為ΔfusR突變，用引物Z0463lambdaredP1和Z0463lambdaredP2擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。所有缺失PCR產(chǎn)物使用pKD4作為模板并凝膠純化（Qiagen）。然后電穿孔PCR產(chǎn)物到制備細(xì)胞并在S.O.C.培養(yǎng)基中恢復(fù)3小時(shí)于30°C，鋪板于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上于37°C過夜。然后篩選菌落對氨芐青霉素敏感性和卡那霉素抗性，并用引物對cra（KCB topo cra FW/KCB topo cra RV）、kdpE（KCB topo kdpE FW/KCB topo kdpE RV）或fusR（Z0463for/Z0463rev）PCR驗(yàn)證基因缺失。為創(chuàng)建非極性突變體，用解析酶質(zhì)粒pCP20解析卡那霉素抗性盒。電穿孔突變體與pCP20，并patch所得菌落for卡那霉素敏感性。通過測序進(jìn)行最終缺失驗(yàn)證。

為構(gòu)建互補(bǔ)質(zhì)粒，每個基因單獨(dú)克隆到Invitrogen pCR-Blunt II-TOPO質(zhì)粒according制造商說明。用NEB Phusion聚合酶以EHEC 86-24為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物以克隆到TOPO質(zhì)粒。用于擴(kuò)增cra（KCB topo cra FW/KCB topo cra RV）、kdpE（KCB topo kdpE FW/KCB topo kdpE RV）和fusR（Z0463for/Z0463rev）PCR產(chǎn)物的引物描述于補(bǔ)充材料表S2。為構(gòu)建互補(bǔ)載體使每個基因相等表達(dá)，使用NEBuilder克隆將每個基因克隆到低拷貝數(shù)質(zhì)粒pACYC184中。用NEB限制酶Eco53kI線性化puc19。

以適當(dāng)TOPO載體（KCB01、KCB02或KCB03）為模板，用NEB Phusion聚合酶PCR擴(kuò)增每個基因如下：cra,Pcat to cra FW/Puc19 to cra RV;kdpE,pcat to kdpE FW/puc19 to kdpE RV;fusR,pcat to fusR FW/puc19 to fusR RV。以pACYC184為模板，擴(kuò)增每個基因的Pcat啟動子如下：cra,puc19 to pcat FW/cra to pcat RV;kdpE,puc19 to pcat FW/kdpE to pcat RV;fusR,puc19 to pcat FW/fusR to pcat RV。線性化puc19和每個基因的PCR產(chǎn)物及相應(yīng)Pcat啟動子PCR產(chǎn)物凝膠純化（Qiagen）后，在50°C孵育20分鐘與NEBuilder HiFi DNA Assembly master mix according制造商說明。然后稀釋連接產(chǎn)物并電穿孔到DH5α細(xì)胞。細(xì)胞在37°C恢復(fù)1小時(shí)。篩選轉(zhuǎn)化體for氨芐青霉素抗性并通過測序與M13 RV作為引物確認(rèn)。這些質(zhì)粒是pKCB04、pKCB05和pKCB06。

為構(gòu)建pACYC184中每個單基因的互補(bǔ)載體，用NEB酶EcoRV和SalI消化質(zhì)粒。pKCB04用SfoI和SmaI消化，pKCB05用SfoI和SalI消化，pKCB06用SfoI和SalI消化（NEB）。消化模板和相應(yīng)基因凝膠純化（Qiagen）后與NEB T4連接酶在16°C過夜連接。連接產(chǎn)物電穿孔到DH5α細(xì)胞，允許在37°C恢復(fù)1小時(shí)。篩選轉(zhuǎn)化體for氯霉素抗性和四環(huán)素敏感性prior通過適當(dāng)引物測序確認(rèn)。這些質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化到相應(yīng)單缺失EHEC菌株以構(gòu)建KCB07、KCB08和KCB09。

為構(gòu)建剩余互補(bǔ)載體在低拷貝數(shù)質(zhì)粒pACYC184中，再次使用NEBuilder方法制作雙和三基因互補(bǔ)。用NEB EcoRV線性化pACYC184并凝膠純化（Qiagen）。為制作kdpE cra互補(bǔ)（pKCB10），PCR擴(kuò)增pKCB05模板用引物p184kdpE to cra FW和p184 to cra RV，pKCB06 PCR擴(kuò)增用引物p184 to kdpE FW和p184 cra to kdpE RV。為制作fusR cra互補(bǔ)（pKCB11），PCR擴(kuò)增pKCB04模板用引物p184 to fusR FW和p184cra to fusR RV，pKCB05模板PCR擴(kuò)增用引物p184fusR to cra FW和p184 to cra RV。為制作fusR kdpE互補(bǔ)（pKCB12），PCR擴(kuò)增pKCB06模板用引物p184 to kdpE FW和p184fusR to kdpE RV，pKCB04模板PCR擴(kuò)增用引物p184kdpE to fusR FW和p184 to fusR RV。

為制作fusR kdpE cra互補(bǔ)（pKCB13），PCR擴(kuò)增pKCB06模板用引物p184 to kdpE FW和p184fusR to kdpE RV，pKCB04模板PCR擴(kuò)增用引物p184kdpE to fusR FW和p184cra to fusR RV，pKCB05模板PCR擴(kuò)增用引物p184fusR to cra FW和p184 to cra RV。每個PCR產(chǎn)物凝膠純化（Qiagen）后與線性化pACYC184和NEBuilder HiFi DNA Assembly master mix在50°C孵育1小時(shí)。然后稀釋連接產(chǎn)物并電穿孔到DH5α細(xì)胞。細(xì)胞在37°C恢復(fù)1小時(shí)。篩選轉(zhuǎn)化體for氯霉素抗性和四環(huán)素敏感性prior通過適當(dāng)引物測序確認(rèn)。這些質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化到相應(yīng)EHEC缺失菌株以構(gòu)建KCB09、KCB10、KCB11和KCB12。