RNA提取和qRT-PCR

對(duì)于有氧搖動(dòng)生長的EHEC菌株，培養(yǎng)在0.1%葡萄糖有或無1 mM丙酮酸DMEM中到OD600 1.0。互補(bǔ)EHEC菌株在有氧搖動(dòng)0.1%葡萄糖DMEM中生長到OD600 1.0。對(duì)于靜態(tài)（微氧）或厭氧室中生長的EHEC菌株，培養(yǎng)6小時(shí)到早期穩(wěn)定期在0.1%葡萄糖DMEM中到OD600 0.6。從三個(gè)重復(fù)提取RNA用RiboPure細(xì)菌分離kit according制造商協(xié)議（Ambion）。如先前描述執(zhí)行qRT-PCR。簡(jiǎn)要地，稀釋提取RNA與驗(yàn)證引物、RNase抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶（AB）混合。混合物用于一步反應(yīng)利用ABI 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)。用ABI序列檢測(cè)1.2軟件收集數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化到內(nèi)源rpoA水平并通過比較臨界閾值方法分析。分析數(shù)據(jù)表示為相對(duì)WT水平的fold變化。使用Student未配對(duì)t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。P值<0.05認(rèn)為顯著。

分泌蛋白的Western blot assay

從培養(yǎng)在0.1%葡萄糖有或無1 mM丙酮酸DMEM中，如先前描述分離分泌蛋白。加20μg牛血清白蛋白到分泌蛋白樣品作為加載對(duì)照。蛋白通過12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用10%牛奶在PBS含0.05%Tween中封閉。膜用抗EspB一抗探測(cè)，洗滌，然后孵育與鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)的二抗。加GE增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，膜暴露于膠片或用Bio-Rad ChemiDoc Touch成像系統(tǒng)（軟件1.0.0.15）與Image Lab 5.2.1軟件顯示圖像。每個(gè)生長條件最少重復(fù)三次。

熒光素肌動(dòng)蛋白染色assay

如先前描述執(zhí)行熒光素肌動(dòng)蛋白染色assay。簡(jiǎn)要地，HeLa細(xì)胞生長過夜到約80%匯合在37°C 5%CO2 on coverslips在孔中含DMEM補(bǔ)充10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺抗生素混合物。感染前，用無抗生素新鮮培養(yǎng)基替換過夜培養(yǎng)基。為感染HeLa細(xì)胞，過夜靜態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)稀釋100:1（細(xì)菌到DMEM）。感染3小時(shí)后，孔再次替換無抗生素新鮮培養(yǎng)基。感染6小時(shí)后，coverslips洗滌、固定和透化。樣品處理with FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽可視化肌動(dòng)蛋白積累和碘化丙啶可視化細(xì)菌DNA和HeLa細(xì)胞核。然后安裝coverslips on slides并用Zeiss Axiovert顯微鏡成像。Pedestal形成量化為每個(gè)附著細(xì)菌形成pedestal的百分比。量化多個(gè)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)coverslips，并用Student未配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。原始細(xì)菌培養(yǎng)系列稀釋也鋪板以確認(rèn)相似CFU比率用于感染。

微氧生長曲線和世代時(shí)間與黏蛋白衍生糖

過夜培養(yǎng)稀釋1:100到96孔Costar板在0.4%指示糖在DMEM中。糖全部購自Sigma，包括D-(+)-木糖、丙酮酸鈉、D-(-)-果糖、L-鼠李糖一水合物、D-(-)-核糖、L-(-)-巖藻糖、D-(+)-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、D-葡萄糖醛酸鈉一水合物、D-半乳糖醛酸鈉、D-葡萄糖酸鈉、D-(+)-甘露糖、D-(+)-葡萄糖和L-(+)-阿拉伯糖。用BMG Labtech FLUOstar Optima微板讀數(shù)器（軟件版本2.10R2，固件版本1.24）每小時(shí)測(cè)量OD前8小時(shí)和再次在24小時(shí)生長。數(shù)據(jù)線性和半對(duì)數(shù)繪圖。世代時(shí)間從半對(duì)數(shù)曲線線性部分計(jì)算如下：Gt=時(shí)間×log(2)/(log最終濃度-log初始濃度)。

蛋白純化和ELISA

pET21基質(zhì)粒表達(dá)EspB用IPTG誘導(dǎo)，并用鎳柱純化蛋白（Qiagen）。His-EspB緩沖交換到PBS用Amicon過濾器before稀釋for標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。對(duì)于酶聯(lián)免疫吸附assay（ELISA），過夜WT和ΔespB突變EHEC培養(yǎng)稀釋1:100到96孔板在0.4%指示糖在DMEM中。用BMG Labtech FLUOstar Optima微板讀數(shù)器測(cè)量早期穩(wěn)定生長階段OD600以確認(rèn)兩菌株生長可比。用4X STOP溶液（0.92 M疊氮化鈉和100μl Sigma蛋白酶抑制劑混合物在PBS中）淬滅細(xì)菌生長。淬滅反應(yīng)混合物稀釋1:2并孵育在Dynatech Laboratories Microtitter ELISA板中。孔用5%牛奶在PBST中封閉。樣品在PBST中洗滌prior孵育與抗EspB一抗和鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)的二抗。板用Sigma TMB顯色并用2N HCl停止。用BMG Labtech FLUOstar Optima微板讀數(shù)器測(cè)量OD450，基于已知對(duì)照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EspB濃度。使用Student未配對(duì)t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。P值<0.05認(rèn)為顯著。

結(jié)果

Cra、KdpE和FusR在生長和毒力中的關(guān)系。

轉(zhuǎn)錄因子Cra、KdpE和FusR直接結(jié)合ler調(diào)控區(qū)以控制LEE基因表達(dá)。為了解決這些轉(zhuǎn)錄因子在LEE調(diào)控中的相互作用，我們構(gòu)建了ΔkdpE、ΔkdpEΔcra、ΔfusRΔcra、ΔfusRΔkdpE和ΔfusRΔkdpEΔcra EHEC缺失菌株。單獨(dú)刪除cra、kdpE或fusR的EHEC無生長缺陷，如先前報(bào)道。然而，組合刪除這些基因可能損害細(xì)菌生長。為了確定雙突變和三突變菌株是否與野生型（WT）在生長上可比，構(gòu)建的缺失菌株在LB或0.1%葡萄糖加1 mM丙酮酸的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中生長。所有缺失菌株與WT EHEC相比無生長缺陷。

由于Cra、KdpE和FusR影響LEE基因表達(dá)（這是AE病變形成所必需的），我們接下來評(píng)估了這些轉(zhuǎn)錄因子在AE病變形成調(diào)控中的作用。為了形成AE病變，EHEC使用專門效應(yīng)器緊密附著哺乳動(dòng)物細(xì)胞并重組肌動(dòng)蛋白以包裹細(xì)菌，形成pedestal樣結(jié)構(gòu)。為了assay刪除cra、kdpE或fusR（單獨(dú)或組合）是否影響EHEC AE病變形成，感染HeLa細(xì)胞并評(píng)估形成的AE病變數(shù)量和每個(gè)病變附著的細(xì)菌數(shù)量。與WT細(xì)菌（41.99±5.46）相比，ΔfusR（56.74±7.11）和ΔfusRΔkdpE（61.52±13.07）菌株顯著更多細(xì)菌附著HeLa細(xì)胞，分別有73.68%、70.67%和77.44%的附著細(xì)菌能夠形成AE病變（圖1A至C）。任何刪除cra的菌株附著HeLa細(xì)胞或與AE病變相關(guān)的細(xì)菌數(shù)量顯著減少。雖然ΔkdpE菌株有更多附著細(xì)菌（61.56±16.74），69.86%形成pedestals，與WT相比，這些數(shù)據(jù)不顯著。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明Cra是EHEC中AE病變形成的強(qiáng)激活劑；然而，單獨(dú)刪除fusR或與kdpE組合顯示這些調(diào)節(jié)器在EHEC附著HeLa細(xì)胞前抑制或改變AE病變形成的動(dòng)力學(xué)。