摘要  

氧氣消耗是評(píng)估胚胎質(zhì)量的有用參數(shù)，因?yàn)樗峁┝苏w代謝活動(dòng)的寶貴指示。多年來，已有幾種方法用于測量單個(gè)胚胎的呼吸速率，但尚未報(bào)道令人信服的方法。在本研究中，我們介紹并驗(yàn)證了一種新型高分辨率微傳感器技術(shù)，用于確定不同發(fā)育階段單個(gè)胚胎的呼吸速率。我們采用該技術(shù)研究了呼吸速率與胚胎形態(tài)、直徑和性別之間的相關(guān)性。經(jīng)過形態(tài)學(xué)評(píng)估后，測定了第3天（n=18）和第7天（n=60）牛體外生產(chǎn)胚胎的單個(gè)呼吸速率。在測量的胚胎中，64個(gè)通過PCR進(jìn)行性別診斷的裂解。第7天胚胎的平均呼吸速率（1.30±0.064 nl/h）是第3天胚胎（0.38±0.011 nl/h）的3.4倍。在第7天，質(zhì)量1的囊胚的平均呼吸速率顯著高于較低質(zhì)量的呼吸速率。對于第3天和第7天胚胎，呼吸速率直接受胚胎直徑影響，但性別之間無差異。這些結(jié)果表明，新型微傳感器技術(shù)可用于準(zhǔn)確快速（8分鐘）測量不同發(fā)育階段單個(gè)胚胎的呼吸速率。呼吸速率僅與胚胎形態(tài)部分一致，表明這兩種方法在評(píng)估胚胎質(zhì)量時(shí)存在輕微差異。很可能，胚胎呼吸和形態(tài)的聯(lián)合評(píng)估將改善胚胎分類和后續(xù)選擇。  

引言  

形態(tài)學(xué)評(píng)估是常規(guī)用于評(píng)估牛胚胎質(zhì)量和后續(xù)存活力的主要且通常是唯一技術(shù)，無論是在實(shí)驗(yàn)工作還是實(shí)踐中。然而，這種評(píng)估本身是主觀的，即使 among 專業(yè)和經(jīng)驗(yàn)豐富的人員也常常無法達(dá)成一致。此外，基于形態(tài)學(xué)選擇胚胎已被證明是困難的，特別是對于中間形態(tài)質(zhì)量的胚胎。因此，需要更客觀的選擇標(biāo)準(zhǔn)，而更好地理解胚胎代謝可能對開發(fā)判斷單個(gè)胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力的新策略非常有用。

胚胎代謝先前已通過測量營養(yǎng)消耗來評(píng)估，如葡萄糖、丙酮酸和氨基酸。然而，氧氣消耗被認(rèn)為是最能指示單個(gè)胚胎整體代謝活動(dòng)的參數(shù)，因?yàn)槿姿嵯佘眨ˋTP）的產(chǎn)生主要來自氧化磷酸化，這是一個(gè)氧氣起關(guān)鍵作用的過程。此外，早期研究提供證據(jù)表明，單個(gè)胚胎的呼吸速率直接與質(zhì)量相關(guān)并與胚胎移植后的存活相關(guān)。因此，量化單個(gè)胚胎的氧氣消耗，結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估，很可能改善選擇胚胎和預(yù)測其發(fā)育能力的標(biāo)準(zhǔn)。

已有幾種方法用于測量植入前胚胎的呼吸速率。首批研究使用卡爾特潛水器技術(shù)測量大量兔卵母細(xì)胞和植入前小鼠胚胎的氧氣消耗。隨后對單個(gè)人類卵母細(xì)胞和囊胚和小鼠囊胚的研究采用分光光度法間接測量胚胎的氧氣消耗，通過確定氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)化為血紅蛋白的量作為氧氣消耗的指標(biāo)。Overstrom開發(fā)了一種帶有固態(tài)氧電極的多通道裝置，能夠測量單個(gè)小鼠和牛胚胎的氧氣消耗。然而，該原型由于靈敏度有限而未廣泛使用。此外，測量耗時(shí)，因此可能干擾胚胎的后續(xù)發(fā)育。

小群小鼠和牛胚胎的氧氣消耗也使用超微熒光技術(shù)測定。該系統(tǒng)利用芘的熒光特性間接測量在存在該物質(zhì)的情況下培養(yǎng)4-6小時(shí)的胚胎群的氧氣消耗。該技術(shù)無法測量單個(gè)胚胎，而且胚胎暴露于培養(yǎng)基中的熒光團(tuán)可能產(chǎn)生副作用，需要進(jìn)一步評(píng)估可能的毒性副作用。

使用自參考微電極技術(shù)量化了單個(gè)無透明帶小鼠胚胎的氧氣消耗，該技術(shù)先前已用于研究各種生物系統(tǒng)。在該技術(shù)中，透明帶被移除，因此報(bào)告的呼吸速率可能無法準(zhǔn)確反映完整胚胎的生理氧氣消耗。  

最近，使用掃描電化學(xué)顯微鏡測定了單個(gè)牛桑椹胚和囊胚的氧氣消耗。測量需要持續(xù)顯微鏡觀察，并且每個(gè)胚胎用持卵針固定，以便在幾個(gè)定義位置進(jìn)行氧氣測量，因?yàn)槟遗弑砻嬗^察到不均勻性。然而，胚胎氧氣消耗產(chǎn)生的梯度是雙曲線的，因此 inherently 難以測量。此外，從單個(gè)胚胎的多次測量中獲得總體呼吸速率既不準(zhǔn)確又耗時(shí)。  

測量單個(gè)胚胎氧氣呼吸速率的理想方法應(yīng)是非侵入性、快速、簡單、準(zhǔn)確、高靈敏度（能夠測量任何發(fā)育階段的單個(gè)胚胎）、可重復(fù)且不影響胚胎后續(xù)發(fā)育。  

在本研究中，我們介紹并驗(yàn)證了一種新型高分辨率超微呼吸系統(tǒng)，以高靈敏度和準(zhǔn)確度確定單個(gè)胚胎的氧氣消耗。我們證明了所開發(fā)的系統(tǒng)適用于非侵入性量化不同發(fā)育階段單個(gè)胚胎呼吸速率的差異。我們進(jìn)一步調(diào)查了體外生產(chǎn)第7天囊胚的單個(gè)呼吸速率是否與形態(tài)學(xué)質(zhì)量和性別相關(guān)，或直接受胚胎直徑影響。 

這項(xiàng)工作的初步結(jié)果較早時(shí)已呈現(xiàn)。  

材料與方法  

所有化學(xué)品均購自Sigma（美國密蘇里州圣路易斯市），除非另有說明。  

納米呼吸計(jì)系統(tǒng) 

下述超微呼吸系統(tǒng)購自Unisense A/S。完整系統(tǒng)的概述見圖1。  

超微呼吸系統(tǒng)由一個(gè)氧氣微傳感器（OX50；尖端直徑40-60μm）組成，這是一種微型克拉克型氧傳感器，90%響應(yīng)時(shí)間小于5秒，且氧氣消耗可忽略不計(jì)。傳感器安裝在電動(dòng)微操縱器（MM33）上，牢固附著在穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室支架（LS18）上，并連接到高靈敏度皮安計(jì)（PA2000），能夠以0.1μmol/l的分辨率記錄來自氧氣傳感器的信號(hào)。然而，此類傳感器信號(hào)對溫度變化略微敏感（每攝氏度信號(hào)增加2-3%）。皮安計(jì)通過A/D轉(zhuǎn)換器（ADC-101）連接到運(yùn)行數(shù)據(jù)采集軟件（Profix版本2.2）的計(jì)算機(jī)。該軟件用于讀取和記錄來自微傳感器的數(shù)據(jù)，并通過電機(jī)控制器（MC-232）控制微操縱器。  

測量單元（即玫瑰座；圖2b）由七個(gè)融合玻璃毛細(xì)管（內(nèi)徑0.68mm，長度3mm）組成，底部密封玻璃，附著在UDEL聚砜（Solvay Advanced Polymers L.L.C, 美國佐治亞州阿爾法利塔市）玫瑰座盤上。玫瑰座放入U(xiǎn)DEL聚砜玫瑰座盤支架中，該支架通過金屬框架附著到實(shí)驗(yàn)室支架上。這三個(gè)組件形成納米呼吸單元（圖2C）。  

為確保測量過程中氧氣和溫度條件穩(wěn)定，專門制作了一個(gè)大型玻璃孵化室，內(nèi)含加熱螺旋和一個(gè)小燒杯。加熱螺旋通過兩根硅膠管連接到溫度控制水浴。大型玻璃孵化室充滿蒸餾水，放在升降臺(tái)和磁力攪拌器上。孵化室中水的溫度由熱傳感器（TP50；Unisense A/S）監(jiān)測，并維持在38.5°C。通過氣泡泵（AP50）產(chǎn)生氣泡，在玻璃孵化室內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)循環(huán)的熱水。燒杯內(nèi)培養(yǎng)基（80ml SOFaaci）由合成輸卵管培養(yǎng)基與氨基酸、檸檬酸和肌醇組成，補(bǔ)充有抗生素（硫酸慶大霉素，10mg/ml）和5%牛血清（CS；丹麥獸醫(yī)研究所，丹麥腓特烈斯貝）。該培養(yǎng)基在恒定流動(dòng)的濕潤5% CO2在19% O2中保持，并在半封閉系統(tǒng)中，因?yàn)闊盟芰仙w覆蓋，中心有開口。通過小磁力攪拌器實(shí)現(xiàn)燒杯內(nèi)培養(yǎng)基的輕柔混合。  

氧氣微傳感器在至少極化2小時(shí)后進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)。第一點(diǎn)（0% O2）使用抗壞血酸（50ml抗壞血酸鈉在50ml NaOH, 0.1M中）。第二點(diǎn)（19% O2）在校準(zhǔn)時(shí)精確的溫度、鹽度和氧氣條件下進(jìn)行，這些條件與胚胎在實(shí)際測量過程中經(jīng)歷的相同。  

最初，傳感器預(yù)定位在玫瑰座中一個(gè)玻璃毛細(xì)管的上開口和中心（即零深度）。這使用解剖顯微鏡（GZ4；Leica Microsystems, 德國韋茨拉爾）手動(dòng)執(zhí)行。隨后，系統(tǒng)的“轉(zhuǎn)輪”設(shè)計(jì)確保通過旋轉(zhuǎn)玫瑰座輕松將玫瑰座中的其他毛細(xì)管帶入分析位置。  

體外胚胎生產(chǎn)  

用于體外生產(chǎn)的方法已在別處報(bào)道。簡而言之，牛未成熟卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）從屠宰場獲得的卵巢中抽吸，選擇（即排除裸露的COCs和有明顯退化跡象的COCs）并在四孔培養(yǎng)皿（Nunc, 丹麥羅斯基勒）中成熟24小時(shí)。每個(gè)孔含有400μl碳酸氫鹽緩沖的TCM-199培養(yǎng)基（Gibco BRL, 英國斯特拉斯克萊德佩斯利），補(bǔ)充有15% CS、10IU/ml馬絨毛膜促性腺激素和5IU/ml人絨毛膜促性腺激素（Suigonan Vet；Intervet Scandinavia, 丹麥斯科夫倫德）。卵母細(xì)胞在礦物油下于38.5°C在5% CO2濕潤空氣中成熟。受精在改良的Tyrode培養(yǎng)基中進(jìn)行，使用凍融、Percoll選擇的精子。22小時(shí)后，通過渦旋去除卵丘細(xì)胞，推定合子轉(zhuǎn)移到400μl培養(yǎng)培養(yǎng)基中，并在38.5°C在5% CO2、5% O2、90% N2氣氛中孵化，最大濕度。胚胎在12個(gè)獨(dú)立重復(fù)中體外生產(chǎn)，每次重復(fù)使用約50個(gè)卵母細(xì)胞。