M.catarrhalis突變體構建

(i)nsrR突變體

使用引物對WW220/WW221和WW222/WW223（圖1B和表2），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴增包含nsrR ORF立即5'和3'核苷酸序列的DNA片段。這兩個DNA片段用作重疊延伸PCR的模板，使用引物WW220和WW223。所得擴增子命名為DNSRR，包含一個內部SmaI位點，用BamHI和SacI消化，然后連接到用相同限制酶消化的M.catarrhalis質粒克隆載體pWW115中。連接反應混合物用于電轉化M.catarrhalis ETSU-9。從一個壯觀霉素抗性克隆中分離的質粒命名為pWW123。從pAC7擴增的kan盒按先前所述克隆到pWW123的DNA插入片段中的SmaI位點。所得重組質粒命名為pWW124，其kan盒以與缺失的nsrR基因相同的方向插入，用作PCR擴增模板，使用引物WW220和WW223。所得PCR產物命名為DNSRR-KAN，用于轉化M.catarrhalis野生型菌株O35E、7169和ETSU-9。卡那霉素抗性轉化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認為nsrR突變體（圖1C）。通過使用上述DNSRR DNA片段轉化卡那霉素抗性的O35E nsrR突變體，構建了一個卡那霉素敏感的nsrR突變體。一個所得卡那霉素敏感轉化子通過核苷酸序列分析確認為nsrR缺失突變體，命名為O35E△nsrR。

圖1.卡他莫拉菌參與截短反硝化途徑的基因產物及相關突變體構建示意圖。(A)卡他莫拉菌的截短反硝化途徑包含圖示的前三個酶促步驟，該菌明顯缺乏將N2O還原為N2的能力（括號標示）。(B至D)分別顯示(B)野生型O35E菌株、(C)O35E nsrR突變體和(D)O35E aniA突變體中包含norB、nsrR和aniA基因及其側翼區域的染色體位點示意圖。PCR所用不同引物的相對位置通過箭頭標示。

(ii)aniA突變體

使用引物對WW216/WW217和WW218/WW219（圖1B），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴增包含aniA ORF立即5'和3'核苷酸序列的DNA片段。這兩個DNA片段用作重疊延伸PCR的模板，使用引物WW216和WW219。所得擴增子命名為DANIA，包含一個內部SmaI位點，用BamHI和SacI消化，然后連接到用相同限制酶消化的pWW115中。連接反應混合物用于電轉化M.catarrhalis ETSU-9。從一個壯觀霉素抗性克隆中分離的質粒命名為pWW121，將上述kan盒克隆到pWW121 DNA插入片段中的SmaI位點。所得重組質粒命名為pWW122，其kan盒以與缺失的aniA基因相同的方向插入，用作PCR擴增模板，使用引物WW216和WW219。所得PCR產物命名為DANIA-KAN，用于轉化M.catarrhalis野生型菌株O35E和ETSU-9?？敲顾乜剐赞D化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認為aniA突變體（圖1D）。

(iii)aniA nsrR突變體

上述PCR擴增子DANIA-KAN用于轉化M.catarrhalis O35E△nsrR突變體。一個卡那霉素抗性轉化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認為nsrR aniA雙突變體。

克隆M.catarrhalis nsrR基因用于互補分析

使用引物WW207和WW210（圖1B），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴增包含野生型nsrR基因的DNA片段。擴增子連接到pWW115的SmaI位點，用于轉化ETSU-9。從一個壯觀霉素抗性轉化子中分離的質粒命名為pWW150，包含野生型ATCC 43617 nsrR基因。

RNA分離和實時qRT-PCR分析

從肉湯生長和生物膜生長的細胞中分離總RNA，如先前所述。定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）按先前所述進行。用于norB（MC ORF 679）、aniA（MC ORF 681）和內生對照MC ORF 1234的qRT-PCR分析的引物對已先前描述。本研究中使用的其他引物列于表2。

通過DNA微陣列分析鑒定NsrR調控基因

從M.catarrhalis野生型菌株O35E、7169和ETSU-9細胞及其nsrR突變體在BHI肉湯中生長的細胞中分離總RNA。如先前所述進行DNA微陣列分析，以鑒定受NsrR影響的基因。進行獨立實驗以獲得來自三個M.catarrhalis菌株對（即同時生長的野生型細胞和nsrR突變體細胞）的六組RNA樣本（每組兩個樣本）。這些樣本包括一組來自7169菌株對，兩組來自ETSU-9菌株對，和三組來自O35E菌株對。進行兩次“染料交換”實驗，一次使用ETSU-9樣本，一次使用O35E樣本。按先前所述進行數據統計分析。通過qRT-PCR分析確認NsrR調控的M.catarrhalis O35E基因表達。進行另外兩個獨立實驗，從M.catarrhalis O35E野生型菌株和nsrR突變體中分離兩組RNA樣本用于qRT-PCR，這些分析對每組RNA制備進行兩次，如先前所述。