討論

過去幾年，人們對細菌病原體還原氮化合物（即反硝化作用）的興趣有所增加。反硝化本質上是將可溶性陰離子氮氧化物還原為揮發性不帶電氣體（NO、N?O或N?），導致局部環境中的氮凈損失。細菌通常將反硝化作為有氧呼吸的替代方式，其中氮氧化物而非分子氧作為電子受體。因此，反硝化用于通過偶聯位點在周質空間排出質子，從而在細胞質膜上產生電化學梯度。與有氧呼吸（其中分子氧在四價還原為水的過程中與末端氧化酶結合）不同，反硝化涉及許多自由擴散中間體的產生，這些中間體與幾種獨立的還原酶相互作用。該反應通常按以下順序進行還原：NO??→NO??→NO→N?O→N?。然而，參與反硝化的酶類型以及反應的完整性在反硝化微生物中存在很大差異。

雖然能夠在多種環境（包括人類宿主）中生存的細菌（例如一些假單胞菌屬物種）具有經過充分研究的反硝化途徑，可將NO??轉化為氣態氮，但直到最近才確定一些專性人類病原體（例如腦膜炎奈瑟菌）也可以將某些氮化合物還原為N?O水平。事實上，在某些條件下，牛分枝桿菌BCG的narGHJI基因簇編碼的硝酸還原酶活性可以在動物模型中促進毒力，而布魯氏菌中反硝化基因調節子NnrA的表達是小鼠毒力所必需的。最近對腦膜炎奈瑟菌的研究表明，NorB一氧化氮還原酶主要負責該病原體的一氧化氮解毒作用，無論是在巨噬細胞中還是在鼻咽黏膜器官培養系統中都是如此。

M.catarrhalis是一種專性需氧菌，不能在厭氧條件下生長。該菌將NO??還原至NO??及更遠水平的能力先前已有記載。然而，直到最近在一項關于M.catarrhalis全局基因調控的研究中才鑒定出可能編碼相關酶的基因。預測編碼硝酸還原酶復合物（NarGHJI）、亞硝酸還原酶（AniA）和一氧化氮還原酶（NorB）的基因被發現在體外生物膜生長時高度上調。在本研究中，我們鑒定了一個ORF（nsrR），當其失活時，允許aniA和norB的表達增加。這種效應不是菌株特異性的，而是發生在本研究中測試的三個不同nsrR突變體中。對相同nsrR突變體轉錄組的DNA微陣列分析表明，至少還有兩個其他ORFs（MC ORF 683和MC ORF 1550）在缺乏NsrR表達的情況下上調。對這四個ORFs緊鄰上游區域的分析顯示，在所有四個實例中都存在一個與先前在其他細菌研究中定義的NsrR結合位點具有同源性的序列。雖然這個推定的NsrR調節子可能看起來相當小，但腦膜炎奈瑟菌中的NsrR調節子最近被證明僅包含五個基因，包括aniA和norB。相比之下，大腸桿菌中的NsrR調節子要大得多，包含至少20個基因。

雖然aniA和norB似乎都是M.catarrhalis中NsrR調節子的成員，但這兩個基因的表達可以響應某些含氮化合物而進行差異調控。當存在NO??時，野生型O35E菌株和O35E aniA突變體中aniA的表達均上調約五倍，即使該aniA突變體不從NO??產生NO。亞硝酸鹽先前已被證明可以至少部分緩解淋病奈瑟菌和歐洲亞硝化單胞菌中NsrR依賴的aniA表達抑制。此外，與腦膜炎奈瑟菌aniA基因的結果類似，化學產生的NO不影響M.catarrhalis aniA基因的表達。

M.catarrhalis nsrR突變體表達norB轉錄本的水平比野生型親本菌株高一個數量級以上。在野生型O35E菌株中，無論是添加亞硝酸鹽還是從spermine NONOate產生NO，norB的表達都增加約兩倍。后一個發現表明，NO可以緩解M.catarrhalis中NsrR依賴的norB表達抑制。在腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌中都觀察到了NO敏感的NsrR對norB轉錄的抑制。由于M.catarrhalis aniA突變體不從NO??產生NO，添加NO??不影響該突變體中norB的表達。

先前已確定，M.catarrhalis在生物膜狀態下生長會導致aniA基因（以及narGHJI和norB基因）的表達水平非常高，這表明很可能存在一種轉錄調節因子，在這種可能缺氧的生長環境中上調aniA的表達。一個候選激活因子是延胡索酸和硝酸鹽還原（FNR）的轉錄調節因子，它響應氧氣而發揮作用，并且先前已被證明是淋病奈瑟菌中aniA基因的轉錄激活因子。對M.catarrhalis ATCC 43617基因組可用核苷酸序列的BLAST搜索未發現任何編碼帶有[4Fe-4S]簇的FNR蛋白的fur基因候選物。此外，對包含大部分（如果不是全部）M.catarrhalis 7169基因組的核苷酸序列的搜索未發現與腦膜炎奈瑟菌MC58的fur在核苷酸或編碼蛋白水平上的同源性。然而，對M.catarrhalis aniA基因上游核苷酸序列的檢查發現了一個推定的FNR結合位點。有趣的是，MC ORF 921編碼一種與DnrD有26%同一性的蛋白，DnrD是一種缺乏[4Fe-4S]中心的調節因子，屬于FNR-CRP調節因子家族的一個新亞組。MC ORF 921編碼的蛋白或另一種調節因子是否參與在氧限制生長條件下激活aniA表達仍有待確定。

本研究的一個意外發現是，在5 mM NaNO?存在下，O35E nsrR突變體的生長被完全抑制；獨立進行的存活實驗表明，亞硝酸鹽對nsrR突變體是抑菌的。添加10 mM NaNO?不影響該nsrR突變體的生長，可能是因為narGHJI基因（編碼硝酸還原酶復合物）在充分通氣條件下表達水平非常低，從而限制了NO??產生的速率。這種對nsrR突變體的亞硝酸鹽依賴性生長抑制可以通過在aniA基因中引入第二個突變或通過反式提供野生型M.catarrhalis nsrR基因來逆轉。nsrR突變體中aniA和norB基因的更高表達導致NO??和NO的消耗增強，同時伴隨著N?O產量的增加。涉及將M.catarrhalis細胞懸液單獨暴露于NO和N?O的額外實驗表明，NO對野生型和nsrR突變體細胞都有輕微的殺菌作用，而N?O對這些細胞的存活沒有明顯影響。在這一點上，觀察到的nsrR突變體在NO??存在下生長抑制的機制仍有待確定。然而，NsrR的表達可能為M.catarrhalis在環境中存在低水平亞硝酸鹽時提供一些保護。

一些細菌表達一種NO誘導的黃素血紅蛋白蛋白（Hmp），一種一氧化氮雙加氧酶，通過在有氧條件下將NO轉化為NO??或在厭氧條件下將NO轉化為N?O，在NO解毒中起重要作用。鼠傷寒沙門氏菌Hmp的表達在需氧和厭氧條件下均受NsrR抑制。在這種腸道病原體中，Hmp是需氧條件下NO代謝的主要負責酶，并且是小鼠模型中毒力所必需的。在大腸桿菌中，Hmp的表達也受NsrR抑制，并且Hmp是NO消耗、賦予亞硝化應激抗性以及保護細菌在巨噬細胞內免于殺死所必需的。野生型鼠傷寒沙門氏菌和nsrR突變體的生長不受亞硝化劑S-亞硝基谷胱甘肽的抑制，而nsrR hmp雙突變體和hmp突變體的生長則被S-亞硝基谷胱甘肽完全抑制。5 mM NO??對M.catarrhalis nsrR突變體生長的完全抑制表明該菌沒有用于NO解毒的Hmp蛋白，對M.catarrhalis ATCC 43617基因組的BLAST搜索未檢測到任何編碼Hmp樣蛋白的基因。相反，M.catarrhalis可能依賴于NorB的表達進行NO解毒。

腦膜炎奈瑟菌和M.catarrhalis似乎共享截短反硝化途徑的一些基本組成部分，盡管只有前者能夠厭氧生長。norB、nsrR和aniA基因在這兩種病原體中的組織結構不同；norB和aniA ORFs在腦膜炎奈瑟菌MC58基因組中彼此相鄰，但反向轉錄，而nsrR基因位于腦膜炎奈瑟菌基因組的其他地方。有趣的是，外源添加的亞硝酸鹽似乎對需氧條件下的M.catarrhalis nsrR突變體有毒性，而腦膜炎奈瑟菌nsrR突變體在氧限制條件下能夠在亞硝酸鹽上生長得更快。此外，與M.catarrhalis nsrR突變體相反，腦膜炎奈瑟菌nsrR突變體在需氧條件下比其野生型親本菌株生長得更慢。這些結果強化了這兩種病原體在呼吸能力方面存在根本差異的事實。

至少一種參與這種截短反硝化途徑的M.catarrhalis基因產物在其人類宿主中生長時表達。AniA蛋白（命名為Msp78）最近被證明存在于M.catarrhalis在COPD患者呼吸道中生長時，這些患者感染了該病原體隨后又清除了感染。類似地，淋病奈瑟菌的AniA蛋白也被證明在人類體內表達。我們實驗室正在進行的研究重點在于進一步闡明控制這種截短反硝化途徑中蛋白質表達的機制，以及這些酶與宿主-病原體相互作用的相關性。

致謝

本研究由美國公共衛生服務基金AI36344資助E.J.H.，由美國公共衛生服務基金AI39557資助F.C.F.。A.R.R.獲得美國公共衛生服務培訓基金T32 AI55396的支持。W.M.H.和D.A.S.得到美國國家科學基金會微生物相互作用與過程基金MCB-0604448資助D.A.S.的支持。

我們感謝John Nelson、Anthony Campagnari和Steven Berk提供本研究中使用的M.catarrhalis臨床分離株，并感謝Anthony Campagnari搜索M.catarrhalis 7169基因組中的fur基因。