材料與方法

標本

采集常見尺寸（體長約30毫米）的標本，來自美國路易斯安那州巴吞魯日（30°24.98'N 91°7.18'W）的一根橡木原木，并將其與采集時所在的木塊一起保存在單獨的容器中。解剖和細菌/古菌群落鑒定在采集日期后約2周進行。

甲蟲解剖、DNA提取和pH測量

將甲蟲在95%乙醇中浸泡2分鐘進行表面消毒，然后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水清洗。在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中解剖單個甲蟲，首先去除鞘翅以暴露膜質背側。隨后，去除翅膀，解剖角質膜以暴露腹腔內的自然腸道排列（圖1）。然后取出整個腸道，拉伸并切成四個區域（前腸-FG、中腸-MG、前中腸-AHG、后后腸-PHG；圖1b）。將每個區域放入1ml RNALater（Qiagen,Valencia,CA,USA）中，并在提取前于4°C儲存過夜。通過將每個腸道區域在含有750μl RLT（硫氰酸胍）緩沖液（Qiagen）的Lysing Matrix E管（Qbiogene Inc.,Carlsbad,CA,USA）中珠磨30秒（5.5 m s-1），冷卻1分鐘，再重復該過程30秒，制備粗提物。使用標準酚-氯仿相分離技術從混合物中分離核酸，并用乙醇沉淀。使用AllPrep DNA/RNA Kit（Qiagen）根據制造商說明進一步純化粗核酸提取物，以同時分離DNA和RNA組分。在另一組四只甲蟲中，通過解剖出每個部分并將腸道內容物在30%水（w v-1）中勻漿，再用微電極測量每個腸道區域的pH。

用于PhyloChip分析的PCR擴增

我們的實驗包括四只甲蟲（重復）和每只甲蟲的四個腸道區域（16個樣本）。每個樣本進行三次重復反應，使用三種不同的退火溫度進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，使用5μl 1 x Takara ExTaq PCR緩沖液（含MgCl2）、300 pM引物27F（5'-GTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）用于細菌，1492R和4F（5'-TCCGGTTGATCCTGCCRG-3'）用于古菌，50μg牛血清白蛋白，200μM dNTPs，2.5 U ExTaq DNA聚合酶（Takara Mirus Bio Inc.,Madison,WI,USA），5ng模板和milliQ H2O補足至50μl體積。PCR循環條件為：95°C初始變性3分鐘，然后進行25個循環：95°C 30秒，退火48°C、53°C和56°C 25秒，72°C延伸2分鐘，最后72°C延伸10分鐘。將三種不同退火溫度的產物（150μl）合并，并使用乙醇沉淀（15μl 3M乙酸鈉和300μl 100%乙醇）進行濃縮。將沉淀重懸于TE（Tris-EDTA）緩沖液中，并在通過凝膠電泳定量前使用PCR純化試劑盒（Qiagen）進行純化。

PhyloChip雜交和樣本檢測

微陣列構建、標記、雜交、檢測和定量方法由Brodie等人詳細描述。G2 PhyloChip包含超過300,000個探針，靶向8741個細菌和古菌分類群。從合并的PCR反應中，取200ng細菌和50ng古菌PCR產物，用DNAse I片段化，生物素標記，根據制造商推薦的方案進行雜交、洗滌和染色。總共分析了16個微陣列。每個PhyloChip被掃描并記錄為像素圖像，使用標準Affymetrix軟件（GeneChip微陣列分析套件，版本5.1，Santa Clara,CA,USA）進行初始數據采集和強度測定。當某個分類群/OTU（操作分類單元）超過90%的指定探針對在至少三個重復（每個腸道區域四個重復）中呈陽性時，則認為該分類群存在于樣本中。

PhyloChip檢測的統計分析

所有統計分析均在R編程環境（The R Development Core Team,2010）中進行。對與擴增子靶標定量相關的變異以及下游與靶標片段化、標記、雜交、洗滌、染色和掃描相關的變異進行了校正，具體方法詳見Ivanov等人。使用方差分析檢驗每個分類群/OTU在四個腸道區域中的強度是否顯著。使用Benjamini-Hochberg錯誤發現率程序對得到的P值進行多重檢驗校正。使用Goldfarb等人中詳述的方法生成檢測到的細菌分類群的系統發育樹，并使用交互式生命樹網絡服務器進行可視化和注釋。

系統發育群落分析

使用Picante R包進行系統發育群落分析。使用G2 PhyloChip靶向序列的最大似然RAxML樹作為初始樹。從未在腸道區域檢測到或具有模糊名稱的分類群從樹中修剪掉，得到一個包含1382個分類群的樹。我們使用了末端洗牌零模型（模型1），運行10000次重復。在該模型中，末端（單個分類群）在整個系統發育中洗牌，并將得到的指標與觀察值進行比較，α=0.05。末端洗牌模型被確定對Phylocom分析具有穩健性，且I類錯誤（假陽性）水平較低。我們使用凈親緣關系指數（NRI）指標來比較不同腸道區域微生物群落的系統發育聚類。我們還確定了系統發育多樣性（PD）和香農多樣性指數（H'；表1）。

表1 鍬甲蟲腸道各區域的系統發育群落指標0. disjunctus腸道菌群的多樣性與功能

通過15N2摻入確認固氮作用

將四只甲蟲放入一個麻醉箱中，該箱連接到一個裝有66 ml O2的氣球，并用99原子%15N2沖洗以達到約78%的N2濃度。孵育12天后，對箱子進行吹掃，取出甲蟲進行解剖和核酸提取，方法同上。通過將提取物移液到錫膠囊中的Chromosorb W（Advanced Minerals,Santa Clara,CA,USA）上，制備用于同位素分析的RNA提取物。使用RoboPrep-CN分析儀與20-20型同位素比質譜儀（Sercon Ltd.,Cheshire,UK）聯用，分析樣品的N含量和δ15N。