NifH表達

我們使用來自三只甲蟲每個腸道區域的100 ng總RNA進行cDNA合成。將總RNA、300 ng隨機六聚體引物和20 nmol每種dNTP混合，總體積為11μl，混合物在65°C孵育5分鐘。然后，向混合物中加入5μl 5x第一鏈緩沖液，以及20U SUPERase-ln（Invitrogen,Grand Island,NY,USA），并在25°C孵育2分鐘。孵育后，向混合物中加入200 U Super-Script III逆轉錄酶（Invitrogen），并在50°C孵育50分鐘。在70°C下使反應失活10分鐘。然后使用cDNA作為模板，使用引物PolF和PolR，以及1689F和2041R對nifH（固氮酶基因）和rpoB（RNA聚合酶β亞基）基因進行定量PCR（qPCR）。使用溫度梯度優化qPCR條件。預期大小的單一條帶（nifH為360 bp，rpoB為390 bp）被認為是準確擴增的指標，并進行克隆和測序以進行驗證并進一步用作qPCR標準品。擴增反應在25μl總體積中進行，包括1μl稀釋（1:10）的cDNA模板、12.5μl 2 x iQ SYBR green super mix（Bio-Rad,Hercules,CA,USA）、0.4μM每種引物和9.5μl水。PCR條件為：95°C 3分鐘，然后進行45個循環：95°C 10秒，隨后在59°C（nifH）和56°C（rpoB）下30秒，使用iQ系統（Bio-Rad）。使用Qubit系統（Invitrogen）通過熒光定量DNA標準品（克隆的rpoB和nifH片段）。每個樣本的閾值循環（CT）值測定三次。對于所有qPCR檢測，標準DNA拷貝數的對數與指定濃度范圍內的計算閾值循環之間存在線性關系（r2=0.98）。確定標準品和樣品的PCR擴增效率在所有檢測中均在98-105%范圍內，檢測下限為每微升20個分子。超出這些范圍（r2<0.98且效率<0.98或>1.1）的運行被重復。使用qPCR效率和樣本閾值，使用2-ΔΔCT方法計算nifH相對于rpoB的標準化表達比率。

NifH克隆、測序和系統發育分析

將來自每個腸道區域的qPCR產物合并，并使用QIAquick PCR純化試劑盒（Qiagen）進行純化。純化的產物用作使用上述nifH引物進行第二次PCR的模板。PCR在25μl最終反應體積中進行，包含5μl 10x ExTaq緩沖液、200μM dNTPs、2.5 U ExTaq DNA聚合酶（Takara Mirus Bio Inc.）、800ngμl-1牛血清白蛋白、10ng模板和焦碳酸二乙酯處理的水。使用pGEM-T Easy Vector Kit（Promega,Madison,WI,USA）將PCR產物克隆到感受態大腸桿菌DH10B細胞中，根據制造商的說明進行。轉化體在改良的溶菌肉湯培養基（0.4%甘油和1.7 mM KH2PO4和7.2 mM K2HPO4）中于37°C和300 r.p.m.下孵育19小時。使用SeqPrep 96 HP質粒制備試劑盒（EdgeBio,Gaithersburg,MD,USA）提取質粒，并使用ABI377測序儀（Applied Biosystems,Grand Island,NY,USA）和M13通用正向和反向測序引物進行測序。使用4Peaks可視化序列，并使用Seaview軟件進行編輯。使用CLC sequence Viewer 6（CLC Bio,Cambridge,MA,USA）在所有讀碼框中翻譯DNA序列。使用Clustal X將翻譯的nifH序列與來自國家生物技術信息中心的相應nifH參考序列進行比對，并在PAUP（系統發育分析使用簡約法）中使用最大簡約標準進行系統發育分析。使用樹二等分重連接模型和分支交換算法進行啟發式樹搜索，進行100次隨機逐步交換。為每個偽重復計算100棵樹。從樹中獲得的重新調整的一致性指數，通過未加權分析得出，用于生成后驗加權數據集。使用與未加權數據相同的啟發式搜索條件來分析加權數據集。通過100次自舉重復獲得分支支持。在每次系統發育重建中，使用Nitrosomonas marina作為外群。

使用微電極進行O2測量

使用一組三只甲蟲測量每個腸道區域的O2分布。使用克拉克型氧微電極（OX-25；Unisense,Aarhus N,Denmark）測量O2濃度。使用前，將電極極化過夜，并在空氣飽和的水中以及由0.1M氫氧化鈉和0.1M抗壞血酸鈉組成的缺氧溶液中進行校準。每次實驗前進行校準。使用Unisense微傳感器萬用表測量電流，并使用SensorTracePRO軟件（Unisense）記錄。在微電極測量之前，將30ml低熔點瓊脂糖（由1%瓊脂糖溶于昆蟲林格氏溶液（111mm NaCl、3.3mm KCl、4.5mm CaCl2、2.8mm Na2CO3）中）澆鑄到微室中。將新鮮解剖的腸道放在這層瓊脂糖上，完全伸展，并立即用30°C的第二層熔融瓊脂糖覆蓋。使用電動顯微操縱器（MXU2；PyroScience,Aachen,Germany）定位微電極。從腸道壁表面（0μm）開始，穿過甲蟲腸道，直到尖端完全穿透整個組織，進行徑向測量。使用連接到計算機的數字顯微鏡（44032；Celestron,Torrance,CA,USA）跟蹤尖端的進展。所有測量均在室溫下進行。

微陣列和核苷酸登錄號

本研究中獲得的微陣列數據和nifH基因序列已存入GEO存儲庫和GenBank，登錄號分別為GSE40067和JX523423-JX523605。