摘要

3-亞磺酰丙酰輔酶A(3SP-CoA)脫亞磺酰酶(Acd_DPN7;EC 3.13.1.4)是在研究β-變形菌門Advenella mimigardefordensis菌株DPN7T中3,3'-二硫代二丙酸(DTDP)分解代謝途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)的。DTDP是一種有機(jī)二硫化物，是細(xì)菌合成聚硫酯(PTE)的前體，在生物技術(shù)PTE生產(chǎn)中具有重要意義。Acd_DPN7催化從3SP-CoA中提取硫，這是DTDP分解代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。本文展示了分辨率為1.89?的脫輔基Acd_DPN7晶體結(jié)構(gòu)，以及分辨率為2.30?的其與底物類似物琥珀酰輔酶A的輔酶A部分形成的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。脫輔基結(jié)構(gòu)顯示，Acd_DPN7屬于?；o酶A脫氫酶超家族折疊，它是一個(gè)四聚體，每個(gè)亞基含有一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)分子。該酶不顯示任何脫氫酶活性。脫氫酶活性需要在246位或366位有一個(gè)催化堿基（Glu或Asp殘基），而在這個(gè)脫亞磺酰酶中，這兩個(gè)位置分別是一個(gè)谷氨酰胺和一個(gè)甘氨酸。輔酶A在晶體復(fù)合物中的定位使得包含3SP-CoA的底物復(fù)合物建模成為可能。這表明Arg84是脫亞磺酰反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵殘基。Arg84Lys突變體顯示出完全喪失酶活性，表明精氨酸的胍基對(duì)脫亞磺酰作用至關(guān)重要。Acd_DPN7是首個(gè)報(bào)道的具有?；o酶A脫氫酶折疊的脫亞磺酰酶，這突顯了這種酶支架的多功能性。

1.引言

圖1 DTDP 的降解過程。二硫鍵化合物3,3‘-二硫代二丙酸（DTDP）通過NADH依賴性二硫鍵還原酶（Wu¨bbeler等，2010）裂解為兩個(gè)3-巰基丙酸（3MP）分子。3MP經(jīng)雙加氧酶（Mdo；Bruland等，2009）氧化生成3-亞磺酰丙酸（3SP）后，琥珀酸-CoA連接酶（SucCD；Schu¨rmann等，2011）催化其活化為3SP-CoA。隨后，3SP-CoA被亞磺酸脫氫酶（Acd）催化水解裂解，生成丙酰輔酶A和亞硫酸鹽。丙酰輔酶A最終通過甲基檸檬酸循環(huán)進(jìn)入中心代謝途徑，而亞硫酸鹽很可能被亞硫酸鹽氧化酶氧化為硫酸鹽。

3-亞磺酰丙酰輔酶A(3SP-CoA)降解為亞硫酸鹽和丙酰輔酶A是3,3'-二硫代二丙酸(DTDP)細(xì)菌分解代謝途徑的最后一步（圖1）。DTDP是一種有機(jī)二硫化物，是聚硫酯(PTE)合成的前體。為了提供一種工程化適合生物技術(shù)PTE生產(chǎn)菌株的策略，對(duì)Advenella mimigardefordensis菌株DPN7T中DTDP降解途徑的闡明以及所涉及基因的鑒定已經(jīng)完成。最近，有報(bào)道稱在β-變形菌門Advenella mimigardefordensis菌株DPN7T的DTDP分解代謝過程中，分離出一種脫亞磺酰酶(EC 3.13.1.4)，該酶催化從3SP-CoA中提取硫。純化的DTDP的降解。二硫化物3,3'-二硫代二丙酸(DTDP)被NADH依賴性二硫化物還原酶裂解成兩分子3-巰基丙酸(3MP)。在雙加氧酶(Mdo)將3MP氧化為3-亞磺酰丙酸(3SP)后，琥珀酰輔酶A連接酶(SucCD)催化其活化生成3SP-CoA。隨后，3SP-CoA脫亞磺酰酶(Acd)催化水解裂解，生成丙酰輔酶A和亞硫酸鹽。丙酰輔酶A最終通過甲基檸檬酸循環(huán)進(jìn)入中心代謝，而亞硫酸鹽很可能被亞硫酸鹽氧化酶氧化為硫酸鹽。

蛋白質(zhì)顯示出約150-200 kDa的天然分子量，表明其為同源四聚體結(jié)構(gòu)，并且每個(gè)亞基含有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔因子，這與酰基輔酶A脫氫酶超家族的其他成員一致。在之前的一項(xiàng)研究中，體外測(cè)定證實(shí)純化的酶將3SP-CoA轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A和亞硫酸鹽，但它無法進(jìn)行脫氫反應(yīng)，這是?；o酶A脫氫酶(Acd)超家族成員通常催化的反應(yīng)。

最近，來自Variovorax paradoxus的Acd_TBEA6、來自Burkholderia xenovorans的Acd_LB400和來自Cupriavidus necator的Acd_N-1被鑒定為?；o酶A家族中的3SP-CoA脫亞磺酰酶，與Acd_DPN7的序列同一性約為60%。這三種Acd均未對(duì)任何測(cè)試的?；o酶A硫酯（即丁酰輔酶A、異丁酰輔酶A、戊酰輔酶A、異戊酰輔酶A、戊二酰輔酶A、琥珀酰輔酶A和3SP-CoA）進(jìn)行脫氫。

除了這些新的脫亞磺酰酶外，迄今為止已報(bào)道了另外三種細(xì)菌酶，它們催化各種底物上的脫亞磺酰反應(yīng)，產(chǎn)生亞硫酸鹽作為最終產(chǎn)物之一。一種是大腸桿菌的吡哆醛磷酸(PLP)依賴性半胱亞磺酸脫亞磺酰酶(CSD;EC 4.4.1.16)，它具有硒代半胱氨酸裂解酶和半胱氨酸脫硫酶?jìng)?cè)活性。第二種是PLP依賴性天冬氨酸β-脫羧酶(EC 4.1.1.12)，它可以接受半胱亞磺酸并催化脫亞磺酰作為副反應(yīng)。第三種酶DszB(EC 3.13.1.3)催化從2'-羥基聯(lián)苯-2-亞磺酸鹽以及2-苯基苯亞磺酸鹽中水解亞磺酰基。已報(bào)道的脫亞磺酰酶均未顯示出與Acds(EC 1.3.8.x)的結(jié)構(gòu)相似性。

Acds屬于黃素酶超家族，主要催化酰基輔酶A硫酯的α,β-脫氫，使用電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(ETF)作為其生理電子受體。Acds主要參與脂肪酸氧化或支鏈氨基酸代謝，但也參與不太常見的細(xì)菌代謝途徑。例如，來自Thauera aromatica的芐基琥珀酰輔酶A脫氫酶參與厭氧甲苯分解代謝途徑，以及參與乙基丙二酰輔酶A途徑的2-甲基琥珀酰輔酶A脫氫酶(Mcd)。

在此，我們報(bào)道了3SP-CoA脫亞磺酰酶Acd_DPN7的兩種晶體結(jié)構(gòu)。分辨率為1.89?的脫輔基酶晶體結(jié)構(gòu)揭示了典型的酰基輔酶A脫氫酶超家族折疊。更具體地說，Acd_DPN7是一個(gè)四聚體，每個(gè)單體含有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合到多肽上的FAD。與琥珀酰輔酶A共結(jié)晶產(chǎn)生了含有輔酶A的全酶復(fù)合物。該結(jié)構(gòu)的分辨率為2.30?，顯示了輔酶A的結(jié)合方式，并為底物結(jié)合提供了線索。晶體結(jié)構(gòu)揭示了活性位點(diǎn)周圍殘基的構(gòu)型，并表明Arg84在脫亞磺酰作用中起著重要作用。誘變顯示Arg84是必需的，結(jié)構(gòu)比較提供了關(guān)于脫亞磺酰酶如何在脫氫酶超家族中出現(xiàn)的見解。

2.材料與方法

2.1.化學(xué)品

純度至少為95%（根據(jù)氣相色譜法）的3SP是使用先前描述的方法合成的，但通過重復(fù)雙-(2-羧乙基)砜中間體的堿裂解步驟進(jìn)行了修改。3SP的合成和純度通過GC和GC/MS進(jìn)行分析。用于酶測(cè)定的3SP-CoA（同樣不可商購）的原位形成是根據(jù)其他地方描述的方法進(jìn)行的。其他輔酶A硫酯，即丙酰輔酶A、丁酰輔酶A、異丁酰輔酶A、戊酰輔酶A、異戊酰輔酶A、琥珀酰輔酶A和戊二酰輔酶A，是通過基于酸酐法的改良技術(shù)合成的。這種改良方法先前已有描述。