2.2.DNA的分離、操作和轉(zhuǎn)移

大腸桿菌的高純度質(zhì)粒DNA通過使用peqGOLD質(zhì)粒小量制備試劑盒I獲得，而質(zhì)量較低的質(zhì)粒DNA則基于Birnboim和Doly的方法進(jìn)行分離。通過凝膠提取純化DNA片段或質(zhì)粒DNA是使用Fermentas GmbH的PureExtreme GeneJet凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商手冊進(jìn)行的。用于DNA消化的限制性內(nèi)切酶也從Fermentas GmbH購買，并按說明使用。來自同一公司的Plusion高保真DNA聚合酶用于基于PCR的擴(kuò)增，擴(kuò)增在peqSTAR 2X梯度熱循環(huán)儀上進(jìn)行。所需的引物由MWG-Biotech AG合成。連接反應(yīng)使用來自Fermentas GmbH的T4 DNA連接酶進(jìn)行。感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是根據(jù)Sambrook等人描述的CaCl2方法進(jìn)行的。DNA測序由Seqlab進(jìn)行，獲得的序列使用NCBI服務(wù)器的BLAST工具進(jìn)行分析。

質(zhì)粒pET-23a::acd_dpn7用作構(gòu)建用于表達(dá)Acd_DPN7變體的突變質(zhì)粒的模板。PCR擴(kuò)增使用Plusion DNA聚合酶進(jìn)行。使用兩個磷酸化引物（其中一個攜帶突變的DNA序列）來擴(kuò)增整個質(zhì)粒。PCR在補(bǔ)充有1%(v/v)DMSO的Plusion高保真緩沖液中進(jìn)行。在98°C初始變性4分鐘后，樣品在peqSTAR 2X梯度熱循環(huán)儀中經(jīng)受30個循環(huán)的變性（98°C，20秒）、退火（61-64°C，30秒）和延伸（72°C，2.5分鐘）。PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化，用來自Fermentas GmbH的T4 DNA連接酶連接，隨后轉(zhuǎn)化到CaCl2感受態(tài)的大腸桿菌Top10細(xì)胞中。通過質(zhì)粒DNA的DNA測序鑒定攜帶所需突變的陽性克隆。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS的CaCl2感受態(tài)細(xì)胞中。

2.3.Acd_DPN7和酶變體的表達(dá)與純化

Acd_DPN7和酶變體在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中的表達(dá)如前所述進(jìn)行。隨后通過離心（4°C，3400g，15分鐘）收獲細(xì)胞，并用無菌鹽水溶液洗滌兩次。棄去上清液，將沉淀物在-20°C下儲存。對于His6標(biāo)簽純化，將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液（100 mM Tris-HCl，500 mM氯化鈉，20 mM咪唑，pH 7.4）中。通過在100 MPa壓力下三次通過冷卻的French press進(jìn)行裂解。在4°C下以10,000g離心1小時后獲得可溶性蛋白質(zhì)級分。His SpinTrap親和柱用于純化初始測試所需的小量酶，按照制造商的說明進(jìn)行。為此，Ni-次氮基三乙酸(NTA)柱用上述結(jié)合緩沖液平衡。使用相同組成和pH但含有40 mM咪唑的緩沖液進(jìn)行洗滌步驟，而洗脫緩沖液需要500 mM的咪唑濃度。對于大規(guī)模純化，將兩個體積為1 ml的HisTrap HP柱串聯(lián)連接，并用五倍體積的上述結(jié)合緩沖液平衡。隨后，使用相同組成但咪唑濃度分別為100和150 mM的緩沖液進(jìn)行兩個洗滌步驟，從而獲得更高的蛋白質(zhì)純度。用500 mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。純化的蛋白質(zhì)以2 mg ml-1的濃度在補(bǔ)充有終濃度為50%(v/v)甘油的洗脫緩沖液中于-20°C儲存。蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Bradford方法測定。

為了在結(jié)晶前進(jìn)一步提高純度，Acd_DPN7經(jīng)過尺寸排阻色譜步驟。Superdex 200 HP 16/600柱用含有150 mM氯化鈉、pH調(diào)節(jié)至7.4的20 mM磷酸鈉緩沖液平衡。使用高分子量凝膠過濾校準(zhǔn)試劑盒進(jìn)行校準(zhǔn)，包括卵清蛋白(44 kDa)、伴清蛋白(75 kDa)、醛縮酶(158 kDa)和鐵蛋白(440 kDa)，按照制造商手冊進(jìn)行。將含有純化酶的總體積為1 ml的樣品上樣到柱上。色譜法在1 ml min-1的恒定流速下進(jìn)行。通過監(jiān)測280 nm處的吸光度來確定洗脫體積。收集含有Acd_DPN7的樣品，合并并置換到10 mM HEPES緩沖液pH 7.4中。

2.4.酶測定

為了檢查脫亞磺酰酶活性，底物3SP-CoA是根據(jù)先前描述的程序合成的。連續(xù)分光光度測定法利用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與亞硫酸鹽的反應(yīng)，導(dǎo)致412 nm處的吸光度增加。動力學(xué)活性通過一式三份測定，使用含有0.2 mM DTNB和不同濃度（0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.025、0.0125、0.0075、0.005和0.0025 mM）的3SP-CoA的測定液，在30°C下于50 mM Tris-HCl pH 7.4中進(jìn)行。通過加入10μl純化酶開始反應(yīng)，最終蛋白質(zhì)濃度為2μg ml-1(44.6 nM)，除非另有說明。一個單位的活性對應(yīng)于在1分鐘內(nèi)催化轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量。

為了研究Acd_DPN7_Q246E突變體催化各種酰基輔酶A硫酯（丙酰輔酶A、丁酰輔酶A、異丁酰輔酶A、戊酰輔酶A、異戊酰輔酶A、3SP-CoA、琥珀酰輔酶A和戊二酰輔酶A）脫氫的能力，使用了基于六氟磷酸二茂鐵鎓的測定法。簡而言之，測定液含有0.2 mM六氟磷酸二茂鐵鎓和0.1 mM相應(yīng)的輔酶A硫酯，在50 mM Tris-HCl pH 7.4中，總體積為1 ml，最終酶濃度為2μg ml-1(44.6 nM)。在300 nm處觀察吸光度。

2.5.AcdDPN7的潛在氧依賴性評估方法  

檢測體系總體積為1 ml，包含終濃度0.2 mM DTNB和0.1 mM 3SP-CoA的50 mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），置于配備橡膠密封墊的比色皿（型號117.104-QS，光程10 mm；Hellma Analytics公司，德國米爾海姆）中。將950 μl檢測液通過通入氮?dú)饣蜓鯕?分鐘，分別制成厭氧或氧飽和狀態(tài)。同時，將含AcdDPN7的50 mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）通過氮?dú)獯祾咧瞥蓞捬鯛顟B(tài)。隨后，該溶液在配備橡膠密封墊的玻璃瓶（型號548-0028和548-0032，VWR International GmbH公司，德國達(dá)姆施塔特）中冰上冷卻。通過連接氣鋼瓶的進(jìn)氣管針持續(xù)通氮?dú)?0分鐘置換頂空氣體，另設(shè)一出氣管針避免超壓。最后，使用上述連續(xù)光譜分析法監(jiān)測AcdDPN7在缺氧與有氧條件下的活性。于30℃預(yù)孵育1分鐘后，加入50 μl無氧酶溶液啟動反應(yīng)，在412 nm波長處持續(xù)監(jiān)測吸光度變化9分鐘。  

體系缺氧或富氧狀態(tài)使用氧微呼吸傳感器（OX-MR，Unisense公司，丹麥奧胡斯）連接皮安電流計（PA2000，Unisense公司，丹麥優(yōu)尼森）按制造商說明進(jìn)行檢測。傳感器采用壓縮空氣飽和水溶液（20℃時284 μM O?）和0.1 M抗壞血鈉/0.1 M NaOH水溶液（20℃時0 μM O?）進(jìn)行校準(zhǔn)。