3.2. Acd_DPN7 3SP-CoA 脫亞磺酰酶與脫氫酶的總體序列和折疊相似性

3SP-CoA 脫亞磺酰酶 Acd_DPN7 與酰基輔酶 A 脫氫酶具有高度的結構相似性，并且每個亞基含有一個 FAD。因此，它與任何先前報道的脫亞磺酰酶在結構上無關。Acd_DPN7 單體 A 與幾種其他酰基輔酶 A 脫氫酶坐標的平均 r.m.s.d. 約為 1.5 ?。Acd_DPN7 已經進化為脫亞磺酰酶，同時保留了酰基輔酶 A 脫氫酶超家族中常見的 38% 的氨基酸殘基。對于酰基輔酶 A 脫氫酶具有脫氫酶活性，在 246 位或 366 位擁有催化堿基（Glu 或 Asp 殘基）是必不可少的。在 Acd_DPN7 中，這兩個位置都沒有發現谷氨酸：在 246 位發現一個谷氨酰胺殘基，在 366 位發現一個甘氨酸殘基。在 246 位或 366 位缺少 Glu 殘基解釋了為什么 Acd_DPN7 和其他最近鑒定的脫亞磺酰酶無法催化任何測試的酰基輔酶 A 底物的脫氫。在對應于 Acd_DPN7 中 Gln246 的酰基輔酶 A 脫氫酶中最常出現的殘是 Gly（七次）、Thr（四次）、Ala（三次）和 Glu（兩次）。在對應于 Acd_DPN7 中 Gly366 的位置，發現最常出現的殘基是 Glu（14 次）和 Ala（兩次）。Gly366Glu 和 Gly366Ala 突變都可以解釋為單核苷酸交換的結果，即從谷氨酸的 DNA 序列 GAA/GAG (Glu) 變為 GGA (Gly) 或 GCA/GCG (Ala)。

3.3. 活性位點的鑒定和表征

來自 Desulfococcus multivorans 的戊二酰輔酶 A 脫氫酶與戊二酰輔酶 A 復合物的結構，以及來自豬肝線粒體的中鏈酰基輔酶 A 脫氫酶與辛酰輔酶 A 復合物的結構，與 Acd_DPN7 3SP-CoA 脫亞磺酰酶結構的疊加表明，圍繞殘基 Arg84、Asp88、Lys118-Ile121、Tyr243-Gln246 和 FAD 異咯嗪環的空腔可能是 Acd_DPN7 3SP-CoA 脫亞磺酰酶的反應中心。為了驗證這一假設，Acd_DPN7 在存在琥珀酰輔酶 A 的情況下結晶，琥珀酰輔酶 A 代表了 3-亞磺酰丙酰輔酶 A (3SP-CoA) 的結構類似物。琥珀酰部分的 C 原子編號為 1-4，位置 4 對應于末端羧酸鹽。在 3SP-CoA 中，位置 4 對應于末端亞磺酰基（圖 3）。共結晶，隨后浸泡琥珀酰輔酶 A，導致琥珀酰輔酶 A 水解。正如 Wischgoll 等人報道的那樣，抑制二羧酸輔酶 A 硫酯的水解是共結晶的主要挑戰，因為從大多數數據集計算的電子密度僅包含輔酶 A。

在 Acd_DPN7 單體 A、B、D、E 和 F 的活性位點中，僅基于電子密度圖可以觀察到輔酶 A 基團（圖 4 ）。對于單體 C，沒有觀察到與輔酶 A 基團相關的電子密度，但在空腔深處模擬了一個琥珀酰基團。在不含底物的情況下計算的 Fo-Fc 差值傅里葉 OMIT 圖，在 3.0σ 輪廓水平（圖 4 ），標記了腺苷基團、核糖醇基團、三個磷酰基團、泛酸部分的羰基和輔酶 A S 原子的位置，從而指導了整個輔酶 A 基團的定位。由 PHENIX 計算的結合在單體 A、B、D、E 和 F 中的輔酶 A 基團的實空間相關系數分別為 0.7、0.81、0.73、0.77 和 0.75。使用 OVERLAPMAP 計算的與 2Fo-Fc 圖的相關因子分別為 0.50(0.66)、0.57(0.70)、0.54(0.63)、0.57(0.69) 和 0.59(0.75)。括號中的值是使用 2Fo-Fc 特征增強圖計算的相關因子（圖 4 ）。

以球棍模型展示的單體B（a、d、g）、D（b、e、h）和F（c、f、i）的輔酶A基團（原子顏色編碼如下：碳，綠色；氧，紅色；磷，品紅色；氮，藍色；硫，黃色）分別擬合于：（上排）FoFc差值傅里葉OMIT圖（綠色網格；等值線水平3.0，未含底物計算）；（中排）2FoFc差值傅里葉圖（藍色網格；等值線水平1.0，使用phenix軟件計算， Adams 等，2010）；（下排）2FoFc差值傅里葉圖（藍色網格；等值線水平2.0，采用phenix的‘特征增強’選項）。

我們精修了五個輔酶 A 基團的占有率，以獲得接近周圍蛋白質殘基觀察到的 B 因子值。單體 A、B、D、E 和 F 的輔酶 A 基團的最終占有率值分別為 0.43(57 ?2)、0.48(61 ?2)、0.57(60 ?2)、0.53(67 ?2) 和 0.59(72 ?2)（括號中給出 B 因子值）。基于 R 因子的完整結構（包括精修的輔酶 A 基團）的 Cruickshank DPI 坐標誤差為 0.3 ?。在脫輔基酶的晶體結構中沒有觀察到讓人聯想到 PEG 存在的電子密度，PEG 用于天然酶和復合物的結晶和冷凍保護，因此也排除了其在復合物結構活性位點中的存在。此外，復合物的結晶或冷凍保護沒有使用甘油，因為其在天然酶的活性位點中 FAD 異咯嗪環上方被觀察到。在復合物結構活性位點的深處，在 2F-Fc 傅里葉圖中僅觀察到少數水分子，輪廓水平為 1.0σ。輔酶 A 基團在 Acd_DPN7 空腔內的定位在單體之間是一致的，從而允許鑒定酶的活性位點。

輔酶 A 的腺苷基團與 Asn244 和 Arg247 的側鏈處于氫鍵距離。特別是，Asn244 的 OD1 原子距離腺苷基團的 N6A 原子 2.9 ?，而 Asn244 的 ND2 原子距離腺苷基團的 N1A 原子 3.2 ?（報告的值是針對單體 D 的，其余單體的值相似）。Arg247 參與輔酶 A 部分的精確定位，正如在我們的結構中觀察到的那樣。在酰基輔酶 A 脫氫酶的其他結構中，對應于 Arg247 的精氨酸殘基是嚴格保守的。在大多數情況下，它們與輔酶 A 酰胺基團的兩個羰基 O 原子相互作用。在中鏈酰基輔酶 A 脫氫酶 (MCADs) 中，有兩個 Arg 殘基與輔酶 A 部分相互作用，分別是 Arg324（與輔酶 A 腺嘌呤環相互作用）和 Arg256（與羰基 O 原子相互作用）。在 Acd_DPN7 中，沒有 MCAD 中 Arg324 的等效物，而 Arg247（對應于 MCAD 中的 Arg256）靠近輔酶 A 的羰基 O 原子和腺嘌呤環。Arg247 可能在識別腺苷基團中起作用。在人類戊二酰輔酶 A 脫氫酶中發現了 Arg250Trp 突變（對應于 Acd_DPN7 中的 Arg247）是致病性的。